*基金项目：国家自然科学基金资助项目(N o .81160264)；广西自然科学基金资助项目(N o .2016G X N S F A A 380267;N o .2018G X N S F A A 281071)ә通信作者,E -m a i l :f a r o n g
m o @126.c o m 收稿日期:2019-01-07
s i R N A 干扰肝癌相关抗原C d c 25C 表达对H e p
a 1-6肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制研究*
栗彦飞1，王栎雯1，周开焕1，宁建铭1，文海名1，陈帝荣1，李丞熙1，莫发荣1,
2ә
(1.广西医科大学基础医学院，南宁 530021;2.广西高校人体发育与疾病研究重点实验室，南宁 530021
)摘要 目的：探讨小干扰R N A (s i R N A )抑制肝癌相关抗原细胞分裂周期蛋白25(C d c 25C )表达对小鼠肝癌细胞H e p a 1-6增殖和迁移的作用及其机制㊂方法：将细胞分为空白对照组(未转染)㊁阴性对照组(转染阴性s i R N A )及3个实验组(转染s i R N A -C d c 25C -1组㊁转染s i R N A -C d c 25C -2组㊁转染s i R N A -C d c 25C -3组)㊂转染8h 后，通过荧光显微镜观察转染效率，并采用W e s t -e r nb l o t t i n g 法检测各组C d c 25C 蛋白的表达，筛选出最有效的s i R N A 序列；用荧光定量P C R (q P C R )法检测内质网应激反应(E R S )相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(G R P 78)㊁X -盒结合蛋白(X B P -1)㊁C /E B P 同源蛋白(C HO P )的表达,C C K -8法和T r a n -
s w e l l 实验检测H e p a 1-6细胞增殖和迁移能力㊂结果：成功构建C d c 25C 低表达的H e p a 1-6细胞株，转染s i R N A -C d c 25C -1组的转染效率最高且C d c 25C 蛋白表达水平最低㊂与阴性对照组比较，转染s i R N A -C d c 25C -1组H e p
a 1-6细胞的迁移率明显降低，细胞增殖抑制率及G R P 78㊁X B P -1㊁C HO P 基因相对表达量明显升高(P <0.05)㊂空白对照组与阴性对照组比较差异均无统计学意义(均P >0.05)㊂结论:C d c 25C 基因低表达能抑制肝癌细胞增殖和迁移，其机制可能与E R S 有关㊂关键词 H e p a 1-6肝癌细胞;C d c 25C ；小R N A 干扰；内质网应激反应中图分类号:R 735.7 文献标志码:A 文章编号:1005-930X (2019)05-0701-06
D O I :10.16190/j
.c n k i .45-1211/r .2019.05.007E f f e c t s o f s i R N A t a r g e t i n g t h e t u m o u r -a s s o c i a t e d a n t i g e nC d c 25C g e n e o n p r o l i f e r a t i o n a n dm i g
r a -t i o no fH e p
a 1-6c e l l s L iY a n f e i 1,W a n g L i w e n 1,Z h o uK a i h u a n 1,N i n g J i a n m i n g 1,W e n H a i m i n g 1,C h e nD i r o n g 1,L iC h e n g x i 1
,M o F a r o n g 1,2
.(1.S c h o o l o fP r e c l i n i c a lM e d i c i n e ,G u a n g x iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,N a n n i n g 5
30021,C h i n a ;2.G u a n -g x iC o l l e g e sa n d U n i v e r s i t i e s K e y L a b o r a t o r y o f H u m a n D e v e l o p m e n ta n d D i s e a s e R e s e a r c h ,N a n n i n g
530021,C h i n a )A b s t r a c t O b j
e c t i v e :T o i n v e s t i g a t e t h ee
f f e c t so f s i l e n c i n
g C d c 25C g e n eo n p r o l i f e r a t i o na n d m i g r a t i o no f H e p a 1-6c e l ll i n e .M e t
h o d s :H e p a 1-6c e l l s w e r et r a n s f e c t e d w
i t he i t h e r m o c k ,n e g
a t i v ec o n t r o ls i R N A ,C d c 25C -s i R N A -1,C d c 25c C -s i R N A -2o rC d c 25C -s i R N A -3.A f t e r 8h o u r s o f t r a n s f e c t i o n ,f l u o r e s c e n t s t a i n i n g
a n dw e s t e r n
b l o t t i n g w e r e u s e d t o s e l e
c t t h e s i R N A w i t h t h e h i g h e s t t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y .T h e e x p
r e s s i o n s o f e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s (E R S )r e l a t e d g l u c o s e r e g u l a t i o n p r o t e i n -78(G R P 78),X -b o xb i n d i n gp r o -t e i n -1(X B P -1),a n dC /E B Ph o m o l o g o u s p r o t e i n (C HO P )w e r ed e t e r m i n e db yq
u a n t i t a t i v ef l u o r e s c e n c e P C R (q P C R ).T h e p r o l i f e r a t i o n a n dm i g r a t i o no fH e p a 1-6c e l l sw e r e e v a l u a t e db y C C K -8m e t h o d a n dT r a n -s w e l l a s s a y ,r e s p e c t i v e l y .R e s u l t s :H e p a 1-6c e l l l i n e w i t hl o w e x p r e s s i o no fC d c 25C w a ss u c c e s s f u l l y c o n -s t r u c t e d .C d c 25C -s i R N A -1w i t h t h e h i g h e s t t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w a s s e l e c t e d f o r s u b s e q u e n t t e s t s .C o m p
a -r i n g t h e n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p t o t h eC d c 25C -s i R N A -1g r o u p ,t h e r ew a s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n c e l l n u m -
b e r a n dm i g r a t i o n r a t eo fH e p
a 1-6c e l l sw i t hC d c 25Cs i R N At r e a t m e n t ,a n dac o n c o m i t a n t i n c r e a s e i nt h e e x p r e s s i o no f
G R P 78,X B P -1a n dC HO P m R N A (P <0.05).N os i g
n i f i c a n td i f f e r e n c ew a s f o u n db e t w e e n t h em o c ka n dn e g a t i v e c o n t r o l s i R N At r a n s f e c t i o n s (P >0.05).C o n c l u s i o n :L o we x p
r e s s i o no fC d c 25Ci n -h i b i t e d t h e p r o l i f e r a t i o na n d m i g r a t i o no fH e p
a 1-6c e l l s ,a n dt h e m e c h a n i s m m i g h t
b er e l a t e dt ot h e E R S .
K e y
w o r d s H e p a 1-6c e l l s ;C d c 25C ;s i R N A ;e n d o -p
l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s ㊃
107㊃广西医科大学学报
J O U R N A L O FG U A N G X IM E D I C A L U NⅣE R S I T Y
张奀宁2019M a y
;36(5)
肝细胞癌(h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a,H C C)是最常见的消化道恶性肿瘤，其复发率和病死率高[1-2]㊂肝癌的发生㊁发展及其转移和扩散机制非常复杂，目前尚未完全明确㊂了解肝癌的发病机制，寻求更加有效的靶点是提高效果的关键㊂细胞周期的异常调控是细胞发生癌变的核心影响因素㊂细胞分裂周期蛋白25(C d c25)是细胞周期调控的关键因素，其中包括C d c25A㊁B㊁C3种亚型结构㊂C d c25C可直接调控G2/M期的转化，维护基因组稳定等重要作用[3]㊂有研究表明,C d c25C作为一种新的肿瘤相关抗原，在多种恶性肿瘤组织中的表达上调[4]㊂此外，在敲除C d c25C的小鼠胚胎成纤维细胞中，细胞周期仍能正常运行，且D N A损伤反应不受干扰，提示C d c25家族蛋白成员之间可能存在代偿作用[5]㊂因此，为进一步研究C d c25C表达与H C C发生㊁发展的相关性，本研究采用小干扰R N A (s i R N A)干扰技术抑制小鼠肝癌细胞H e p a1-6中C d c25C基因的表达，观察其对肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制㊂1材料与方法
1.1细胞株与主要试剂小鼠肝癌细胞株H e p a1-6由广西生物靶向诊治研究重点实验室惠赠，本实验室保存㊂D M E M培养基(美国H y C l o n e公司)；胎牛血清(F B S，美国G i b c o公司);L i p o f e c t a m i n e T M 2000(美国I n v i t r o g e n公司);C C K-8试剂盒(日本同仁公司);P V D F膜(美国B D公司)；超敏E C L化学发光试剂盒(美国F D b i o公司);C d c25C多克隆抗体(S a n t aC r u z公司)；兔抗小鼠C d c25C抗体购自英国A b c a m公司；逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；荧光定量P C R(q P C R)试剂盒(日本T a k a r a公司)㊂
1.2s i R N A的合成针对C d c25C的s i R N A和阴性对照s i R N A由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，序列见表1㊂用B l a s t进行序列对比，阴性对照的s i R N A序列与C d c25C基因以及靶细胞内其他基因均无明显同源性㊂
表1s i R N A序列
O l i g o名称序列(5 ~3 )
s i R N A-C d c25C-1上游C C U U G A C C U U U C G A A U C U U T T
下游A A G A U U C G A A A G G U C A A G G T T s i R N A-C d c25C-2上游G G A C A A U G G U U C C U U G G A U T T
下游A U C C A A G G A A C C A U U G U C C T T s i R N A-C d c25C-3上游G C G U A G C A C A U C U G C A C A U T T
下游A U G U G C A G A U G U G C U A C G C T T s i R N A-N C(阴性对照)上游U U C U C C G A A C G U G U C A C G U T T
下游A C G U G A C A C G U U C G G A G A A T T
1.3细胞培养与转染将H e p a1-6细胞用含10%
F B S的D M E M培养液，于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养㊂取对数生长期的H e p a1-6细胞，消化㊁离心，收集细胞㊂用
含有血清的完全培养基重悬细胞，以4ˑ105个/孔的细胞密度接种于6孔板中㊂待细胞生长至70%融合时进行转染，转染按照L i p o-f e c t a m i n e T M2000转染试剂盒说明书操作㊂转染8h 后，在荧光显微镜下观察细胞，计算转染效率㊂转染效率=有绿荧光的H e p a1-6细胞数/总H e p a1-6细胞数㊂细胞分为空白对照组(未转染)㊁阴性对照组(转染s i R N A-N C)及3个实验组(转染s i R N A-C d c25C-1组㊁转染s i R N A-C d c25C-2组㊁转染s i R-N A-C d c25C-3组)㊂
1.4 W e s t e r nb l o t t i n g法检测C d c25C蛋白的表达
提取细胞总蛋白,B C A法测定蛋白浓度；各组取等量细胞总蛋白于S D S-P A G E电泳分离蛋白，转至P V D F膜,5%脱脂奶粉封闭1h；兔抗小鼠C d c25C一抗稀释液(1ʒ800)在4ħ下孵育过夜，洗膜；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔l g G二抗(1ʒ5000)室温孵育2h，洗膜;E C L显㊁发光，拍照㊂用I m a g e J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-a c t i n蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量㊂依据不同质粒转染后的转染效率及C d c25C蛋白表达量，筛选出最佳干扰质粒，进行后续实验㊂
1.5q P C R法检测细胞内质网应激反应(E R S)相关分子的表达提取细胞总R N A，逆转录为c D N A，在荧光定量P C R仪(瑞士R o c h e公司)上进行P C R 扩增㊂P C R反应体系:S Y B R P r e m i xE x1
2.5μL, T a qⅡ1μL，上㊁下游引物各1μL，模板D N A2μL,
㊃207㊃广西医科大学学报2019M a y;36(5)
加8.5μLd H2O至总体积25μL㊂P C R反应条件: 95ħ预变性10m i n;95ħ变性5s,60ħ退火和延伸30s，共40个循环；最后添加熔解曲线:95ħ5s, 60ħ30s,95ħ15s㊂用2-әәC t方法计算目的基因相对表达量㊂引物序列见表2㊂
表2q P C R引物序列
基因序列(5 ~3 )
G R P78上游G A A G A G C T G T G C T C G G A C C T
下游C A G C A G C T T C T G C A C C T T G G
X B P-1上游C A G C A A G T G G T G G A T T T G G A A G
下游T C T T A A C T C C T G G T T C T C A A C C A C A C HO P上游G T C A C A C G C A C A T C C C A A A
下游G T T C T T C C T T G C T C T T C C T C C T C G A P D H上游T G T G T C C G T C G T G G A T C T G A
下游T T G C T G T T G A A G T C G C A G G A G 1.6 C C K-8法检测细胞增殖分别在转染24h㊁48h和72h时检测细胞增殖情况㊂细胞分为空白对照组㊁阴性对照组及转染效率最高的实验组㊂调整细胞浓度为5ˑ103个/孔，接种于96孔板；每孔加入C C K-8溶液10μL，继续培养4h㊂用酶标仪检测480n m波长处的吸光度(O D)值，细胞增殖抑制率(%)=(O D阴性对照组-O D实验组)/(O D阴性对照组-O D空白组)ˑ100%㊂
1.7 T r a n s w e l l法检测细胞迁移能力收集各组细胞,0.25%胰酶消化，吹打成单细胞悬液；调整细胞浓度为2ˑ105个/孔，接种于24孔板，每组设3个复孔，于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养；待细胞达80%融合时，用无菌200μL移液器吸头在培养皿底部划 十 字;P B S冲洗3次，加入含血清的培养液继续培养；分别在划痕后0h㊁12h㊁24h于倒置显微镜下观察划痕区域的变化，选择同一视野标记并拍照㊂实验重复3次㊂
1.8统计学方法采用S P S S19.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数ʃ标准差( xʃs)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义㊂
2结果
2.1筛选C d c25C最佳干扰质粒镜下可见空白对照组和阴性对照组均无荧光显示，转染s i R N A-C d c25C-1组㊁转染s i R N A-C d c25C-2组㊁转染s i R-N A-C d c25C-3组的转染效率分别为81%㊁73%㊁54%，见图1㊂
W e s t e r nb l o t t i n g结果显示：空白对照组㊁阴性对照组㊁转染s i R N A-C d c25C-1组㊁转染s i R N A-C d c25C-2组㊁转染s i R N A-C d c25C-3组H e p a1-6细胞C d c25C蛋白相对表达量分别为1.02ʃ0.07㊁0.91ʃ0.05㊁0.43ʃ0.02㊁0.54ʃ0.07㊁0.52ʃ0.04，实验组与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P <0.01)，见图2㊂结果表明，转染s i R N A-C d c25C-1组干扰效率最高且C d c25C蛋白表达量最低，因此，后续实验选择s i R N A-C d c25C-1进行基因转染
㊂
图1转染8h后各组细胞绿荧光蛋白的表达(ˑ100)
㊃307㊃栗彦飞，等.s i R N A干扰肝癌相关抗原C d c25C表达对H e p a1-6肝癌细胞增殖和迁移的影响及机
制研究
1：空白对照组;2：阴性对照组;3：转染s i R N A-C d c25C-1组;4：转染s i R N A-C d c25C-2组5：转染s i R N A-C d c25C-3组㊂图2 W e s t e r nb l o t t i n g蛋白电泳图
2.23组细胞增殖和迁移能力比较细胞转染24h 时，转染s i R N A-C d c25C-1组与阴性对照组细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；转染48h和72h时,s i R N A-C d c25C-1组细胞增殖抑制率较阴性对照组明显升高(P<0.05或P<0.0
1)；空白对照组与阴性对照组细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3㊂在划痕12h㊁24h后,s i R N A-C d c25C-1组细胞增殖抑制率均较阴性对照组明显升高(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组细胞迁移率比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，见图3㊂
2.3干扰C d c25C对E R S的影响q P C R结果显示，转染s i R N A-C d c25C-1组细胞中G R P78㊁X B P-1及C HO P基因相对表达量均高于阴性对照组(P< 0.05或P<0.01)；空白对照组与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4㊂
表33组细胞增殖能力比较( xʃs)
组别
增殖抑制率/%
24h48h72h 空白对照组0.000.000.00阴性对照组0.006.00ʃ0.058.00ʃ0.09转染s i R N A-
C d c25C-1组13.00ʃ0.0225.00ʃ0.07**21.00ʃ0.02*
与阴性对照组比较,*P<0.05或**P<0.01㊂
与阴性对照组比较,*P<0.05㊂
图33组细胞迁移能力比较
A:G R P78基因相对表达量;B:X B P-1基因相对表达量;C:C HO P基因相对表达量㊂与阴性对照组比较,*P<0.05或**P<0.01㊂
图4下调C d c25C对H e p a1-6细胞E R S相关蛋白的影响
㊃407㊃广西医科大学学报2019M a y;36(5)
3讨论
C d c25C是调控细胞周期的关键分子，又是一种新的肿瘤相关抗原㊂研究表明,C d c25C在多种癌组织中呈高表达[5]㊂O z e n等[6]通过研究C d c25C在前列腺癌组织及细胞系中的表达，发现C d c25C与前列腺癌的发生发展及预后密切相关㊂W a n g等[7]进一步证实,C d c25C过表达对于女性外阴鳞状细胞癌的发生和发展发挥重要作用㊂此外，食管鳞状细胞癌患者放射的敏感性与组织中C d c25C高表达有关[8]㊂本课题组前期利用原核表达系统重组表达C d c25C蛋白，并检测H C C患者㊁病毒性乙型肝炎患者㊁肝硬化患者及正常人血清中C d c25C抗体出现率，结果发现H C C患者血清中的阳性率为85.2%，显著高于正常人的57.3%[9]㊂随后本组制备了C d c25C特异性多肽多克隆抗体[10]，以原位杂交法和免疫组织化学法分别在基因水平和蛋白质水平证实了C d c25C表达与H C C发生发展呈正相关关系(数据待发表)，但其发病机制尚不清楚，有待进一步研究㊂
内质网是一种重要的细胞器，主要负责蛋白质的折叠㊁组装和转运，以及钙离子储存等㊂但由于肿瘤生长迅速，血管生成不足等因素常导致细胞微环境发生改变，因而出现大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白堆积㊁C a2+发生紊乱的现象，即E R S㊂E R S早期，在未折叠蛋白反应的作用下发挥其保护性机制，维护细胞的存活㊂然而，持续或严重的E R S又可诱导细胞凋亡[11]㊂研究发现,E R S发生时,G R P78和未折叠蛋白质反应标志物X B P-1表达上调，内质网相关信号通路的异常调控与肝癌的发病密切相关[12]㊂W e i等[13]实验表明，内质网应激相关蛋白G R P78㊁C HO P㊁X B P-1表达增加与促细胞凋亡蛋白活性增强密切相关㊂诱导内质网应激，促细胞死亡的机制对于研究抗肿瘤药物及肿瘤耐药性可能是至关重要的㊂因此，内质网应激相关蛋白可能是肝癌中的一个重要的分子靶点[14-15]㊂
本研究结果表明，特异性干扰C d c25C的表达可以诱导小鼠肝癌细胞H e p a1-6发生E R S，激活内质网应激相关信号通路蛋白分子表达升高，并抑制肝癌细胞的增殖，降低细胞的迁移水平㊂这与L o 等[16]的研究结果，抑制周期蛋白A和C d c25C的表达可以诱发细胞凋亡，有效地抗肿瘤增殖相一致㊂本研究采用瞬时转染的方式，研究下调C d c25C表达后对小鼠肝癌细胞生物学功能的影响及其机制，下一步本组将利用本次实验确定的小R N A干扰序列及转染条件，进一步构建C d c25C稳定低表达的慢病毒载体，进行稳定的细胞转染和长期观察㊂
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