穿心莲内酯纳米混悬剂的制备及评价
王静娴;李文;陈婷;李俊松
【摘 要】OBJECTIVE To established the andrographolide nanosuspensions (ADG-NS) with improved its dissolution and membrane permeability.METHODS ADG-NS were prepared by wet media milling technique.The quality of the nanosuspensions was characterized including the particle size and distribution, Zeta potential, particle morphology and crystal physical state.In vitro dissolution test and Caco-2 permeability test were used to preliminarily evaluate the ADG-NS.RESULTS The particle size, polydispersity index (PDI) and Zeta potential of ADG-NS were (215.6 ± 3.3) nm, 0.165 ± 0.020 and (-36.9 ± 2.8) mV, respectively.SEM analysis showed that there was no adhesion and aggregation between particles, the particles were rod or block, and the size distribution was uniform.DSC and XRPD results showed that the nanoparticles were present in the amorphous form.The dissolution rate of ADG-NS were significantly enhanced in different pH buffer solutions compared to ADG and commercial dripping pills.Caco-2 permeability test revealed that AD
G-NS showed a significant increase in the membrane permeability (Papp) compared to the group of ADG (P<0.01).CONCLUSION The ADG-NS prepared by wet media milling technique can improve the in vitro dissolution rate and membrane permeability of andrographolide (ADG).%目的 制备穿心莲内酯纳米混悬剂(ADG-NS),并对其进行表征和评价.方法 采用介质研磨法制备ADG-NS,对其粒径及分布、Zeta电位、粒子形态、结晶状态进行表征,采用体外溶出度试验和Caco-2细胞转运试验对ADG-NS进行初步评价.结果 ADG-NS的粒径、多分散性系数、Zeta电位分别为(215.6 ± 3.3) nm、0.165 ± 0.020和(-36.9 ± 2.8) mV.扫描电子显微镜(SEM)分析结果显示,粒子多呈棒状或块状,大小分布较均匀.差示扫描量热(DSC)和x射线粉末衍射(XRPD)分析结果显示,纳米混悬剂中的药物以无定型态存在.与原料药及穿心莲内酯滴丸比较,ADG-NS在不同pH值溶出介质中,溶出速率显著提高.Caco-2细胞单层细胞渗透试验表明,与原料药相比,ADG-NS显示较高的膜渗透性.结论 ADG-NS可以提高穿心莲内酯的体外溶出度与膜渗透性.
【期刊名称】《南京中医药大学学报》
【年(卷),期】2017(033)003
2020年三伏天时间表
【总页数】4页(P313-316)
【关键词】穿心莲内酯;纳米混悬剂;介质研磨;体外溶出;Caco-2细胞
【作 者】王静娴;李文;陈婷;李俊松
【作者单位】南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023
【正文语种】中 文
【中图分类】R283.6
穿心莲内酯(ADG)为二萜类内酯化合物，是中药穿心莲代表效成分之一，拥有“天然抗生素”的美称，具有较好的抗菌、抗炎、抗肿瘤及保肝作用[1-4]，是一个极具发展潜力的药物。但ADG水溶性差(0.07 mg/mL)[5]、溶出度低，是P-gp外排的底物，极大地影响了药物的口服吸收，口服生物利用度仅为2.67%[6]。因此，有必要利用合适的剂型与辅料改善穿心莲内酯的上述缺点。
纳米混悬剂(Nanosuspensions)是利用适量稳定剂将药物分散在介质中，并通过粉碎或控制析晶的技术形成的稳定的纳米胶态分散体[7]。该技术能够将药物纳米化，增加其比表面积，从而提高难溶物的的溶出速率和溶解度。此外，制成纳米混悬剂后，会增加药物在黏膜的黏附性，可使药物在胃肠道内的滞留时间延长，进一步增加其在胃肠道的吸收[8]。纳米混悬剂的制备方法主要包括沉淀法、介质研磨法和高压均质法等[9]。其中介质研磨法生产效率高、操作简单、可控性强、重现性好以及应用广泛，应用该技术上市的产品有惠氏制药公司的西罗莫司片剂、默克制药公司的阿瑞吡坦胶囊剂和雅培制药公司的非诺贝特片剂等[10]。
本文采用介质研磨技术，以生物相容性好、具有P-gp抑制作用的表面活性剂聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)作为稳定剂制备穿心莲内酯纳米混悬剂(ADG-NS)，在此基础上对穿心莲内酯纳米混悬剂进行表征和评价。
1.1 试剂
穿心莲内酯原料药(ADG，含量为98%，上海源叶生物科技有限公司)；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS，美国Sigma公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，上海阿拉丁生化科技有限
公司)；穿心莲内酯滴丸(天津天士力制药集团股份有限公司)；甘露醇(国药集团化学试剂有限公司)；Caco-2细胞株(美国ATCC)；维拉帕米(上海源叶生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基、非必需氨基酸、胎牛血清、青霉素和链霉素(美国Gibico公司)；水为高纯水，其余试剂均为分析纯。葛淑珍照片
1.2 仪器
介质研磨机NT-0.3L(东莞市琅菱机械有限公司)；LABCONCO 6L 冻干机(美国Labconco公司)；纳米粒度分析仪(英国Malvern公司)；JSM-5610LV扫描电镜(日本Rigaku公司)；D/Max-2500PC X-射线衍射仪(日本Rigaku公司)；DSC-204差示扫描量热仪(德国Netzsch公司)；A ZRS-8G 溶出仪(天津天大天发科技有限公司)；Waters e2695高效液相谱仪(美国Waters公司)；Millicell ERS-2 跨膜电阻仪(美国Millipore公司)；HY-45气浴恒温生物摇床(江苏金坛市金城国盛实验仪器厂)；BP211D型电子分析天平(德国Satrorius公司)；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(美国Milli-Q公司)。
2.1 ADG-NS及其冻干粉的制备
yy微风
精密称取1 g穿心莲内酯，加入200 mL含有稳定剂(0.484 g TPGS，0.356 g SLS)的溶液中，匀浆机16 000 r/min高速剪切5 min，然后将上述混悬液倒入介质研磨机(0.3～0.4 mm氧化锆小珠850 g)中，在转速1 755 r/min下研磨1.4 h，制得ADG-NS。
将甘露醇加入上述ADG-NS，其最终含量为1%(w/v)，混合均匀，装入西林瓶中，每瓶5 mL。于-80 ℃冰箱预冻12 h，再放置于冷冻干燥机中，-20 ℃维持10 h，-10 ℃维持5 h，0 ℃维持2 h，25 ℃维持2 h，制备得到ADG-NS冻干粉。
2.2 粒径和Zeta电位的测定
取适量ADG-NS与ADG-NS冻干粉分别用双蒸水稀释和复溶至适当浓度,置于纳米粒度分析仪中，测定其粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位。其测定结果见表1。ADG-NS冻干粉复溶于水后能很好地恢复ADG-NS原有的粒径、PDI与Zate电位。
2.3 扫描电子显微镜(SEM)分析
取ADG-NS冻干粉适量，点附于导电胶带上并在真空下镀金240 s后用SEM观察。SEM的操作加速电压为15 kV。结果如图1A所示，ADG粒径为100 μm左右。ADG-NS粒径为200
nm左右，粒子多呈棒状或块状，粒度分布较均匀，粒子之间未见粘连和聚集现象。
2.4 差示扫描量热(DSC)分析
将SDS、TPGS、ADG、ADG与稳定剂的物理混合物(PM)和ADG-NS冻干粉进行DSC分析。测定参数：升温速率为5 ℃/min，升温范围为30～300 ℃，空铝盘作为空白对照，测定载气为氮气。结果如图1B所示。由图可知，ADG在240 ℃存在熔融峰，SDS两个熔融峰分别在110 ℃和193 ℃，TPGS和甘露醇分别在40 ℃和175 ℃存在熔融峰。PM在40、106、180 ℃均存在熔融峰，分别为TPGS、SDS及ADG左移的熔融峰。ADG-NS不存在ADG熔融峰，表明纳米混悬剂中ADG以无定型状态存在。
2.5 X-射线衍射(XRPD)分析
卡戴珊 全裸将SDS、TPGS、ADG、PM和ADG-NS冻干粉分别填塞在样品皿中，使用Ni-滤波器，Cu Ka射线，40 kV的电压和25 mA的电流，在3～40°的2θ范围内以2°/min速率进行扫描，结果见图1C。由图可知，ADG在5.00°、9.94°、12.10°、14.90°、15.76°、17.54°、19.92°、22.72°、30.08°和33.88°有衍射峰，说明其是晶体结构。在PM中，ADG晶体特征
仍存在，但峰强度降低，可能是稳定剂与药物相互作用影响峰的强度。在ADG-NS中，ADG晶体衍射峰消失，以无定型态存在，说明介质研磨的过程破坏了ADG的晶体结构。XRPD结果进一步验证了DSC结果。于月仙
2.6 体外溶出度试验
精密称取ADG、PM、ADG滴丸和ADG-NS冻干粉适量(相当于ADG 15 mg)，按《中国药典》2015年版附录XC溶出度测定法第二法有关规定进行测定。溶出介质为pH 1.2、pH 4.5和pH 6.8缓冲液，温度为(37±0.5)℃，转速为75 r/min。分别于5、10、20、30、45、60 min时取样5 mL(随即补足等温度等量的溶出介质)，14 000 r/min离心10 min，采用HPLC测定ADG的含量，并计算不同时间的累积溶出度。
谱条件：Kromasil C18谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-水(65∶35)；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长225 nm；进样量：10 μL。结果如图2所示。
实验结果表明，PM、ADG滴丸和ADG-NS较ADG在不同pH值缓冲液中的溶出速率均明显提高。与PM和ADG滴丸相比，ADG-NS在不同pH值缓冲液中的溶出速率亦明显提高。AD
G-NS 10 min内，在不同pH值缓冲液中溶出基本完全。在pH 1.2溶出介质中，溶出时间60 min时，ADG-NS的溶出度分别为ADG、PM和ADG滴丸的3.57、1.43和1.37倍。在pH 4.5的溶出介质中，溶出时间60 min时，ADG-NS的溶出度分别为ADG、PM和ADG滴丸的3.79、1.28和1.38倍。在pH 6.8的溶出介质中，溶出时间60 min时，ADG-NS的溶出度分别为ADG、PM和ADG滴丸的4.76、1.37和1.40倍。可见将ADG制备为ADG-NS后能显著提高ADG的溶出度，原因是原料药经介质研磨处理后，粒径减小，提高了药物的表面积，从而有效提高药物的溶出度与溶出速率。
胡杏儿黄宗泽2.7 Caco-2细胞单层模型转运试验
实验前，取细胞培养完整的小室吸去顶端和底端的培养液，将其与pH值6.5的空白HBSS于37 ℃共培养30 min后，用空白HBSS对细胞单分子层清洗3次，以洗去细胞表面的杂质。将供试制剂加至Apical侧作为供给液，在Basolateral侧加入pH值6.5的空白HBSS 0.8 mL作为接收液，把加好溶液的Transwell培养板置于转速为50 r/min 的37 ℃恒温水浴摇床中，分别在设定的时间(0、30、60、90、120 min)吸取接收池和供给池溶液400 μL，同时补足同体积相应的溶液，试验平行做3份，实验结束后测定其电阻值。样品经HPLC测定药物浓度，谱条件同"2.6"项下，并照下式计算表观渗透系数Papp，结果见表2。