实验五  酵母菌形态的观察和显微镜下细胞测量和计数
刘洋  生物101  1002040120
一、实验目的
1、观察酵母菌的形态，掌握区分酵母菌死活细胞的染方法。
2、掌握利用显微测微尺测量酵母菌大小的方法。
3、学习利用血球计数板测定微生物细胞数量的原理和方法。
二、实验原理
（一）酵母菌的形态观察
酵母菌是单细胞真核微生物，细胞呈圆形、椭圆形或柱状。酵母的细胞比细菌大得多，经过特殊的染，在高倍镜下就可以观察到。酵母菌既可无性繁殖，又可有性繁殖。无性繁殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4~8个子
囊孢子。在一定条件下，有的酵母菌进行芽殖后，长大的子细胞不与母细胞立即分离，并继续出芽，细胞成串排列，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。
隐秘的角落解析细思极恐酵母菌的死活细胞可以通过美兰染加以区分。美兰是一种无毒性染剂，其氧化型为蓝，还原型为无。由于活细胞具有较强的还原能力，可以使美兰由蓝的氧化型转变为无的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰的能力强，细胞为无，为代谢缓慢的老细胞、幼嫩芽体为浅蓝，死细胞为深蓝。
（二）显微镜下的细胞计数
本次实验采用血球计数法测定微生物细胞数。方法是将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），所以可以将在显微镜下计得的菌数换算成单位体积试样中的菌数。
血球计数板使一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，而每演员张少华
个中方格又被分为16个小方格。这样正中央的大方格总共分成400个小方格，每个小方格的体积为1/4000 mm3（计数室的高度为0.1mm）。由此得到如下公式：
（三）显微镜下细胞大小的测量
用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分可有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每小格长10μm。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上。将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。
三、实验材料
1、菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）
2、染剂：0.1%美兰染液
3、培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）
4、其他：血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺、载玻片、盖玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具
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四、实验方法
（一）酵母菌的形态观察
1、芽殖观察
（1）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴一滴美兰染液，用接种环取少量酿酒酵母菌苔在染液中涂匀。再用镊子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，用吸水纸吸干多余液体。
（2）观察：将水压片置于高倍镜下观察。观察芽殖和死、活细胞的颜。30min之后，再次观察死、活细胞数是否发生了变化。
2、假菌丝的观察
（1）培养：将热带假丝酵母划线接种与马铃薯葡萄糖培养基平板表面，28℃培养2天，取出培养物，在无菌条件下，将一实现灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养2天。
（2）观察：打开培养皿盖，与高倍镜下直接观察
3、酿酒酵母菌子囊孢子的观察
于高倍镜下观察子囊孢子装片，注意子囊孢子的数目和形状。
（二）显微镜下的细胞计数
1、制备菌悬液：用无菌接种环在酿酒酵母菌斜面上刮下适量菌苔，将菌苔分散在盛有5ml无菌水的试管中，充分振荡。
2、加菌液：先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取着凉酿酒酵母菌悬液滴入上下两个计数室内，盖上盖玻片，不能有气泡，否则重做。
3、计数：现在显微镜下到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，计数每个中方格中的菌数，填入下表，并计算单位体积的菌数（个/ml）。
（三）显微镜下细胞大小的测量
1、校正目镜测微尺
（1）安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝下放入目镜筒，然后旋好螺旋，插入显微镜筒。
（2）放置镜台测微尺：将镜台测微尺放在载物台上，使刻度面朝上。
（3）校正：在显微镜下观察，调准焦距，当看清镜台测微尺后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，然后移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两条刻度线完全重合，在数出两条重合先之间各自所占的格数，根据公式得到校正后的目镜测微尺每小格的长度。
2、制酿酒酵母水压片：取一洁净载玻片，在中央滴一滴上面制备的菌悬液，小心盖上盖玻片，用吸水纸将多余的液体吸干，不能产生气泡。
3、测量酿酒酵母菌体大小：将酿酒酵母水压片放在载物台上，在显微镜下看清菌体后，转动目镜测量酵母细胞菌体的直径，共需测量10个细胞。
五、实验结果及分析
（一）酵母菌的形态观察
1、美兰染后，观察到视野中细胞呈圆形或椭圆形，大部分呈白，少部分呈蓝。可见芽殖，较大的母体细胞旁边有一较小的芽体，母体细胞白，芽体浅蓝。而在子囊孢子的观察中，可见四个呈菱形的子囊孢子靠在一起，相互之间以及孢子于环境之间都有透明的子囊壁隔开。芽殖和子囊孢子如下图1所示。
2、假菌丝的观察
（二）显微镜下的细胞计数
将计得菌数填入下表1。
表1 酿酒酵母的血球计数板计数
格数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
平均数
数目
5
6
6
5
7
6
5
3
4
5.375
根据公式，计算所得单位体积的菌数如下：
（三）显微镜下细胞大小的测量
1、目镜测微尺的校正结果
表2 目镜测微尺刻度的校正
物镜
物镜倍数
目镜测微尺格数
镜台测微尺格数
目镜测微尺每格代表的长（μm）
高倍镜
40
20
5
2.5
2、测量结果
表3 酿酒酵母细胞大小的测量
she烧伤
菌细胞编号
1
2
3
4
5
6
目镜测微尺格数（长轴）
4.3
4.3
4.5
3.2
4.6
5.2
目镜测微尺格数（短轴）
4.3
4.1
2.5
2.7
4.1
关联词有哪些
3.6
菌体大小(um*um)
115.6
110.2
70.3
54.0
117.9
117.0
菌细胞编号
7
8
9
10
平均数
目镜测微尺格数（长轴）
4.5
4.9
4.1
4.9
4.4
目镜测微尺格数（短轴）
1.8
2.5
2.7
2.8
3.6
菌体大小(um*um)
50.6
76.6
69.2
85.8
96.5
由上表可知，酿酒酵母细胞平均大小为4.4×3.6μm，而细胞的大小范围是（3.2~5.2）×（1.8~4.3）μm。
3、班级数据汇总：
3.1酿酒酵母的血球计数板计数
3.2酿酒酵母细胞大小的测量
描述性统计结果：
六、思考题
台湾的特产
1.用美兰染时，如何在光学显微镜下区分酵母细胞代谢活性的强弱？
2.用光学显微镜观察酵母菌体时，其在制片和染方面与细菌有何差别？
3.为什么说热带假丝酵母的菌丝是假菌丝？
七、总结
1、制备待计数菌悬液时，为避免无菌水中菌体密度过大影响观察，接种环刮去培养基表面少量菌苔即可。但问题在于对于实验室中未知菌落数量大小的观察，是否有一个统一公认的方法，否则每个人取量不一致，那么实验的可重复性非常低，对于科研论文等则缺乏客观性，也因此希望老师能够明示。
2、计数时需要充分摇匀后计数，否则对于同一批样品因前后取样时间差异，也会导致两个数据间存在较大差异。从而造成结果上的不准确。