实验室必备技能：免疫荧光组织细胞固定和破膜不得不说的故事
做免疫荧光实验的时候，要想得到好的实验结果，组织细胞的固定和破膜至关重要。固定的目的在于将组织和细胞结构保存完好，终止细胞内酶的活动及其他代谢活动，提供我们想研究的某个时间点的真实情况。
而破膜则是为了开疆辟土搭鹊桥，喜送抗体见抗原。因为如果需要检测的抗原在细胞内，抗体在细胞外飘啊飘，不到机会与细胞内的抗原手牵手一步两步把染（如果要检测的抗原在细胞膜外表面或细胞外基质，那么不用破膜。因为在不破膜的情况下，抗体也能和抗原红尘作伴，活得潇潇洒洒，策马奔腾，共享染之华）。
你的脚步在天涯常用的固定剂和破膜剂中有很多英雄好汉，如下表。
固定剂 | 甲醛，戊二醛，甲醇/丙酮 |
破膜剂 | 情组词Triton X-100, NP-40, Brij-58, 皂苷, 洋地黄皂苷, 甲醇/丙酮 |
虽然他们都有一身好武艺，但在固定和破膜界各有所长。兵法曰：知己知彼，方能百战不殆。要想获得好的固定和破膜效果，有哪些不得不知道的知识点呢？请听小编娓娓道来！
固定剂界的翘楚
1
甲醛
几乎在每个实验室都有甲醛的传说，源于它作为固定剂的职业道德操守极好。对于免疫荧光实验来说，在大多数情况下，甲醛是最好的固定剂。它是一种相对较温和的固定剂，在常温下一小时，4%的甲醛可穿透的距离约2毫米。小鼠脑组织用4%甲醛固定过夜，效果还不错。而对于培养的细胞，用2-4%甲醛(用pH7.4的PBS配制)固定15分钟即可(20摄氏度)。
另外，固定甲醛本身导致的背景信号对实验影响不大。相比戊二醛来说，它不影响免疫表位的识别。由于买的瓶装甲醛很多含有甲醇，相对而言，效果没有用多聚甲醛现配现用的甲醛好。因此，使用购买的甲醛前，最好看看成分。一般建议，使用多聚甲醛现配现用甲醛，以获得更好的效果。
2
戊二醛
戊二醛，可以给组织细胞的细微结果提供最好的呵护，通常可用于电镜和一些免疫荧光实验，比如微管定位。
霍思燕的活好是真的吗
蜜雪薇琪但是，戊二醛也有矫情的一面，它常可导致免疫表位的改变，这让抗体不得与抗原你侬我侬。有时候可导致一些非特异性荧光的出现。2%的戊二醛在常温下，一个小时可穿透约700微米的组织。
有些实验室会将戊二醛和甲醛联合使用进行组织细胞固定，利用的就是这两种固定剂各有所长。于是出现了下图的斗嘴日常。
这对小冤家听说这样的互补关系可能很棒，于是在媒婆的鼓动下，他们走进了婚姻的殿堂，从此夫妻双双把固定做。
3
甲醇/丙酮
冰甲醇或冰丙酮固定速度较甲醛和戊二醛快，也在固定界有所建树。比如，他们可以用于细胞骨架成分的固定。不足之处在于他们在固定的同时会改变一些抗原的位置。另外，由于他俩在固定的同时也会破膜，有些细胞内的可溶性抗原就会在破膜处嗨起来，出去浪，这样一来，如果你要检测的刚好是这些可溶性抗原，那么，结果就不好说了。再者，由于固定同时会发生脱水，所以组织细胞可能会发生皱缩，不再维持原本水灵灵的模样。
在使用上述各种固定剂时，需要注意的是，固定时间与切片厚度和固定剂的特点相关，不同固定剂所需固定时间和浓度不同。如果固定时间不够，可导致细胞形态保存不佳，失去细胞本来的面貌，或失去我们想检测的令我们心动的信号。然而，固定过度也可能导致失去想要检测的信号，或在出现更多非特异性的背景信号，这无疑会影响你切片的美。
破膜剂界的精英
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尹子维Triton X-100, NP-40和Brij-58
常用的破膜剂有Triton X-100, NP-40和Brij-58。他们都能通过溶解磷脂膜，让抗体和抗原破除膜的阻挠，千里相会，成就一段美好姻缘。通常情况下，在常温或冰上以浓度0.1%-0.5%作用5分钟左右即可，这些破膜剂通常在固定后使用。但是，有些实验室建议固定和破膜同时进行，所以会把固定剂和破膜剂混在一起使用。还有些实验室建议先破膜后固定。笔者试过先固定后破膜，以及同时固定破膜，效果都较理想。
2
皂苷
皂苷较上述三种常用破膜剂，对细胞膜的损害较小，通过溶解膜的胆固醇起到破膜作用。这个皂苷很有意思，如果你选择用他，那么，见证奇迹的时刻都要有他，即在抗体孵育阶段以及洗涤阶段他都需在场，因为如果不在场呢，破掉的膜就复原封闭了。正是由于皂苷
林志颖 陈若仪这个温和的特点，他可用于细胞膜结构比较重要的研究。常在室温情况下使用浓度0.5%即可。
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