季节性流感病毒每年都在人与人之间传播，温带地区易在冬季暴发。接种流感疫苗是预防季节性流感的最有效方法。2006年9月，WHO发起全球流感行动计划（Global Action Plan for Influenza Vaccines，GAP），目的是提高流感疫苗产能，以满足大流行期间全球流感疫苗的供应［1］。2012年2月，WHO授予长春百克生物科技股份公司采用WHO提供的毒株研发、生产和销售三价流感减毒活疫苗（live atte-nuated influenza vaccine，LAIV）的许可。
目前，流感疫苗在世界范围内仍以灭活疫苗为主。灭活疫苗仅能激发机体的体液免疫，且需大剂
孙瑶1，申镇维2，3，姜春来1，孟祥博4，徐菲1
1.吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室，吉林长春130012；
2.长春百克生物科技股份公司，
吉林长春130012；3.吉林大学第一医院转化医学研究院免疫学研究所，吉林长春130061；
4.吉林大学中日联谊医院胃肠内科，吉林长春130033
摘要：目的建立基于MDCK细胞的三价流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法，并进行验证。方法以抗流感病毒血清中和三价流感减毒活疫苗中两种型别病毒，采用CCID50法检测未中和型别病毒感染性滴度，并对方法的专属性、线性、准确性、精密度、耐用性进行验证。结果样品中的辅料成分、其他型别病毒和异源抗病毒血清均不会对病毒滴度测定结果产生干扰；该方法检测H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度的线性范围分别为3.81～8.48、3.48～
7.65和2.45～6.98logCCID50／0.2ml，在线性范围内，线性回归系数（R2）分别为1、0.9946和0.9945；该方法检
测3种型别流感病毒滴度重复性和中间精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%，平均回收率在85%～115%之间；同一样品不同时间点检出结果差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论建立的CCID50法专属性、准确度、线性、精密度、耐用性良好，是一种简便、快速、成本低、检测误差小的方法，可用于三价流感减毒活疫苗病毒滴度的检测。
关键词：CCID50；三价流感减毒活疫苗；病毒滴度；MDCK细胞
中图分类号：R373.1+3R392-33文献标识码：A文章编号：1004-5503（2016）09-0978-06
Development and validation of a CCID50method for determination
of influenza virus titer
SUN Yao*,SHEN Zhen-wei,JIANG Chun-lai,MENG Xiang-bo,XU Fei
*National Engineering Laboratory for AIDS Vaccine,College of Life Science,Jilin University,
Changchun130012,Jilin Province,China
Corresponding author:XU Fei,E-mail:feixu@jlu.edu
Abstract：Objective To develop and validate a Madin-Darby canine kidney（MDCK）cell line based potency assay to test the titer of trivalent live attenuated influenza vaccine.Methods The infectious titer of non-neutralized virus was determined by CCID50method.The test was validated for specificity,linearity,accuracy,precision and robustness.Results The virus preservers,other viral strains and heterologous antisera in samples showed no influence on the determination result of virus titer.The linear ranges of titers of influenza H1N1,H3N2and B viruses were3.81~8.48,3.48~7.65 and2.45~6.98logCCID50／0.2ml,with R2values of1,0.9946and0.9945,respectively.The relative standard deviations（RSD s）of reproducibility and intermediate precision of virus titers of the three types were less than15%,while the mean recovery rate was85%~115%.The determination results of
the same sample at various time points showed no significant difference（each P>0.05）.Conclusion The developed CCID50method showed high specificity,linearity, accuracy,precision and robustness,which was simple,rapid,low-cost and with small error,and was suitable for determination of virus titer of trivalent live attenuated influenza vaccine.
Key words：CCID50;Trivalent live attenuated influenza vaccine;Virus titer;MDCK cells
·技术方法·
基金项目：吉林省科技发展计划项目“创新生物技术药物的开发”课
题（140901GX010013647）.
通讯作者：徐菲，E-mail：feixu@jlu.edu
DOI:10.13200/jki.cjb.001458
量接种或添加佐剂才能达到免疫效果。与灭活疫苗相比，流感减毒活疫苗具有模拟天然感染的特点，能诱导体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫；提供针对不同型别流感病毒的交叉免疫、保护更持久；对2～18岁人保护效果更好［2］；抗原需求量小，产量是灭活疫苗的10倍以上，易于满足流感流行时对疫苗的巨大需求。
目前检测流感减毒活疫苗病毒滴度主要采用鸡胚法［3］，但鸡胚法操作复杂，检测误差大且周期长。CCID50法常用于评价口服脊髓灰质炎疫苗［4］、麻腮风疫苗［5］等多价疫苗中的单一毒株效价，而国内尚无成型的通过细胞法测定三价流感减毒活疫苗滴度的方法。本研究旨在采用MDCK细胞检测流感减毒活疫苗的病毒滴度，并对方法进行优化及验证，使其适用于流感减毒活疫苗病毒单价原液和三价成品的检测需要，达到快速、准确测定流感病毒滴度的目的。
1材料与方法
1.1毒株流感减毒疫苗株为WHO提供的2011～2012年北半球季节性流感病毒甲型［A／17／Califo-rnia／09／38（H1N1），A／17／Perth／09／87（H3N2）］和乙型［B／56／Brisbane／60／08（B）］毒株［6］。该疫苗株系通过经典基因重组技术，将野生型甲型［A／California／07／2009（H1N1）、A／Perth／16／2009（H3N2）］和乙型（B／Brisbane／60／08）流感病毒，分别与俄罗斯医学科学研究院实验医学研究所（Institute of Experimental Medicine，IEM）提供的甲型［A／Leningrad／134／17／57（H2N2）］和乙型（B／USSR／60／69）主供体株进行重配，筛选出具有野毒株HA、NA抗原基因和主供体株6个内部基因的重组毒株，同时具有良好的抗原性和减毒（att）、冷适应（ts）以及温度敏感（ca）特性。重配毒株经长春百克生物科技股份公司传代后制备成原液供本实验使用。
1.2细胞MDCK细胞由长春百克生物科技股份公司提供。
1.3主要试剂流感减毒活疫苗稳定剂（BH-5，含蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、谷氨酸钠、尿素、精氨酸、葡萄糖、人血白蛋白）由长春百克生物科技股份公司提供；抗流感病毒羊血清购自英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）：anti-A／California／7／2009（H1N1）HA血清（Anti-H1）NIBSC code：09／152，anti-A／Perth／16／2009（H3N2）HA血清（Anti-H3）NIBSC code：10／182，anti-B／Brisbane／60／08（B）HA血清（Anti-B）NIBSC code：10／146；高糖型DMEM培养基、TPCK-胰酶和3%L-谷氨酰胺溶液购自美国Sigma公司；特级胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司；HEPES购自吉诺生物医药技术有限公司。
1.4ＣＣＩＤ５０法检测流感病毒滴度
1.4.1流感样品与中和血清的处理将单价流感减毒活疫苗原液、PBS与BH-5按1∶2∶7混合，制成单价疫苗备用；3种型别流感减毒活疫苗原液与BH-5按1∶1∶1∶7混合，制成三价疫苗备用。将三价疫苗与0.2倍体积的抗病毒血清混合，以中和相应型别病毒。单价疫苗原液、单价疫苗或三价疫苗样品经32℃水浴处理30min后，进行滴度检测。1.4.2病毒生长液的配制配制含98%DMEM、1%L-谷氨酰胺、1%HEPES的溶液，补加TPCK-胰酶至终浓度为1μg／ml。
1.4.3流感病毒滴度检测MDCK细胞用含10%胎牛血清的培养液稀释后，加入96孔板中，
2.0×105个／孔，培养19～24h细胞贴壁并汇合；弃去培养液，加入PBS，200μl／孔，洗板2次，以除去残留血清，向板中加入经病毒生长液10倍系列稀释的病毒样品，200μl／孔，每个样品设2个平行样，每个平行样做6个复孔，阴性对照加入病毒生长液，每个样品各设6个对照孔，置33℃，5%CO2培养箱中孵育6d后，镜检观察细胞病变，并采用Karber法计算病毒滴度。
1.5病毒生长液中ＴＰＣＫ-胰酶含量的优化分别以TPCK-胰酶终浓度为0.5、1、
2.5、5μg／ml的病毒生长液进行10倍系列稀释，依1.4项方法检测病毒滴度。分别计算各型别病毒在不同浓度TPCK-胰酶作用下滴度的变化，选择最佳TPCK-胰酶含量。1.6方法的验证依照ICH Topic Q2（R1）指导原则对方法进行验证。
1.6.1专属性验证设计4个平行试验，每个样品平行测定3次。①3种病毒单价原液、单价疫苗分别与相应型别抗病毒血清混合处理，如H1N1+（Anti-H1）；三价疫苗与3种型别抗病毒血清混合处理，即三价疫苗+Anti-（H1+H3+B）。并分别检测流感病毒滴度。②检测3种型别病毒单价原液的流感病毒滴度。③检测3种型别病毒单价疫苗的流感病毒滴度。④检测三价疫苗中单一型别流感病毒滴度，如三价疫苗+Anti-（H1+H3）混合处理后，可检测B型流感病毒滴度。
1.6.2线性验证用PBS分别将H1N1、H3N2、B 型流感病毒原液样品10倍系列稀释（101、102、103、
104），测定原液样品及上述4种稀释后样品的病毒滴度。将样品滴度对相应稀释倍数的对数值绘制回归曲线，并计算回归系数（R2）。
1.6.3准确度验证分别测定单价原液与三价疫苗中H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度，每个样品平行测定3次。以H1N1、H3N2和B型流感病毒单价原液滴度换算为10倍稀释后滴度作为理论值，计算各型别病毒在三价疫苗中的平均回收率，并计算3个回收率的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
餐饮业会计1.6.4精密度验证
1.6.4.1重复性在同一天、由同一实验员分别测定三价疫苗中H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度，每个样品平行测定6次，并计算RSD值。
1.6.4.2中间精密度在不同日、由不同的实验员对同一批次的三价疫苗中3种型别流感病毒滴度进行测定，每种样品平行测定3次，并计算RSD值。1.6.5耐用性验证分别对三价疫苗中3种型别流感病毒滴度进行测定，每种样品平行测定3次，在加毒后第5、6、7天分别统计CPE，计算当日所得滴度，并将各型别病毒第5、7天检测结果分别与第6天检测结果对比，计算RSD和P值［统计学软件：SPSS20.0，判定方法：（等方差双侧）t检验，以P＜
0.05为差异有统计学意义］。
1.6.6验证结果的可接受标准根据美国FDA出台的生物分析方法指导原则，规定本验证方案结果的可接受标准［7］。在专属性验证中，加入的血清应完全中和相应型别病毒，单价疫苗原液、单价疫苗和三价疫苗中单一型别病毒滴度应无明显差异，即疫苗稳定剂、其他型别病毒及抗病毒血清对病毒滴度检测无干扰；在线性验证中，线性范围内曲线线性相关系数（R）应大于0.99；在准确度验证中，以回收率表征准确度，回收率范围应在85%～115%内；在精密度验证中，病毒滴度检测的RSD应小于15%；在耐用性验证中，不同时间点检测的病毒滴度应无明显差异。
2结果
成人高考的学历有用吗2.1病毒生长液中ＴＰＣＫ-胰酶最佳含量检测结果显示，病毒生长液中TPCK-胰酶含量为1.0μg／ml 时检测H1N1、N3N2、B型3种型别病毒滴度的结果均优于TPCK-胰酶含量为0.5μg／ml组，且差异均有统计学意义（P值分别为0.000006、0.002和0.009）；当病毒生长液中TPCK-胰酶含量大于1.0μg／ml时，细胞出现脱落，明显影响对细胞病变的统计。见表1。因此本实验选择病毒生长液中TPCK-胰酶含量为1.0μg／ml。
2.2方法的验证结果
2.2.1专属性分别对H1N1、H3N2和B型流感病毒单价原液、单价疫苗与三价疫苗进行加入同种抗病毒血清处理，结果检测时间内均无病毒生长，表明所选用的抗病毒血清在与待检样品体积比为1∶5处理
后，可完全中和样品中相应型别的流感病毒，中和效果不受待检样品中辅料成分和异源抗病毒血清的影响。3种型别单价原液、单价疫苗和对应三价疫苗病毒滴度检测结果的RSD均低于5%，且3种测试样品检测结果无明显差异，表明样品中的辅料成分、其他型别病毒和异源抗病毒血清均不会对检测方法产生干扰，方法专属性较好。见表2。
2.2.2线性检测结果表明，该方法检测H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度的线性范围分别为
3.81～8.48、3.48～7.65和2.45～6.98logCCID50／0.2ml，在线性范围内，R2分别为1、0.9946和0.9945，见图1。该方法线性能达到对病毒滴度测定的要求。
表1含不同浓度TPCK-胰酶的病毒生长液中3种型别流感病毒的滴度（logCCID50／0.2ml）
Tab1.Titers of influenza H1N1,H3N2and B viruses in growth medium containing various concentrations of TPCK-trypsin （logCCID50／0.2ml）
病毒型别
H1N1N3N2B
0.51 4.667 6.646 5.667长满、未脱落
2 4.479 6.667 6.313
3 4.667 6.813 5.667
1.018.4797.646 6.979长满、未脱落
28.6467.313 6.979
38.3137.479 6.813
2.5---脱落
5.0---脱落
TPCK-胰酶含量（μg／ml）平行样阴性孔细胞形态
表23种型别流感病毒单价原液、单价疫苗与三价疫苗经同源或异源抗病毒血清处理后的细胞半数感染量（logCCID 50／0.2ml ）Tab 2.CCID 50of influenza H1N1,H3N2and B viruses in monovalent and trivalent vaccine preparations treated with homologous or heterologous antisera （logCCID 50／0.2ml
）
平行样
1231H1N1单价原液Anti H1无病毒生长无病毒生长无病毒生长-2H3N2单价原液Anti H3无病毒生长无病毒生长无病毒生长-3B 型单价原液Anti B 无病毒生长无病毒生长无病毒生长-4H1N1单价疫苗Anti H1无病毒生长无病毒生长无病毒生长-5H3N2单价疫苗Anti H3无病毒生长无病毒生长无病毒生长-6B 型单价疫苗Anti B
无病毒生长无病毒生长无病毒生长-7三价疫苗Anti （H1+H3+B ）
无病毒生长无病毒生长无病毒生长-8H1N1单价原液-8.4798.4798.146H1N19H1N1单价疫苗-7.3137.146 6.813H1N1 3.50a 10三价疫苗Anti （H3+B
）7.479 6.9797.146H1N1 3.30b 11H3N2单价原液- 6.979 6.9797.146H3N212H3N2单价疫苗- 5.813 5.813 6.146H3N2 2.49c 13三价疫苗Anti （H1+B
） 6.313 6.146 6.479H3N2 4.36d 14B 型单价原液-7.3137.313 6.979B 15B 型单价疫苗- 6.146 5.979 5.979B 2.68e 16
三价疫苗
Anti （H1+H3
） 6.313
5.979
5.979
B
2.30f 注：
引用3种型别流感病毒单价原液滴度计算RSD 时，应将表中所示滴度换算为10倍稀释后滴度，即（原液滴度值-1）。表中a 表示8与9号样品数据的RSD ；b 表示8与10号样品数据的RSD ；c 表示11与12号样品数据的RSD ；d 表示11与13号样品数据的RSD ；e 表示14与15号样品数据的RSD ；f 表示14与16号样品数据的RSD 。
A ：H1N1型；
B ：H3N2型；
C ：B 型。
图1H1N1、H3N2和B 型流感病毒线性验证结果Fig 1.Validation of linearity of developed method for determination of virus titer
2.2.3准确度检测结果表明，该方法检测3种型别流感病毒滴度的回收率均在85%~115%之间，见表3。表明该方法准确度较好。
表33种型别流感病毒在三价疫苗中检测的准确度（log CCID 50／0.2ml ）
Tab 3.Accuracy of influenza virus of three types in trivalent influenza vaccine （logCCID 50／0.2ml
）病毒型别
H1N1H3N2B 单价原液
18.479 6.9797.3132
8.479 6.9797.31338.1467.146 6.979三价疫苗
17.479 6.313 6.3132 6.979 6.146 5.9793
7.146 6.479 5.979平均回收率（%）97.77104.6098.24RSD （%）
3.95
1.50
3.11
2.2.4精密度
2.2.4.1重复性
在同一天由同一个实验员对三
价疫苗流感病毒滴度进行测定，3种型别流感病毒
滴度6次检测结果的RSD 均小于15%，见表4。表明该方法重复性较好。
编号样品抗病毒血清检测型别
RSD （%）
样品样品编号
8765431205
431
20
稀释倍数的对数
病毒滴度
（l o g C C I D 50／0.2m l ）
C y ＝-1．0833x +7．0461
R 2＝0．989
98765431205
431
20病毒滴度（l o g C C I D 50／0.2m l ）
B y ＝-1．05x +7．5128
R 2＝0．9893
稀释倍数的对数
98765431205
43
1
20
病毒滴度（l o g C C I D 50／0.2m l ）
A
y ＝1．1667x +8．4795
R 2＝1
稀释倍数的对数
表4三价疫苗中3种型别流感病毒6次检测结果（logCCID50／0.2ml）
Tab4.Six test results of titers of influenza virus of three types in trivalent vaccine（logCCID50／0.2ml）
病毒型别
H1N1H3N2B
17.646 6.646 5.979
27.479 6.313 5.979
37.313 6.646 5.979
47.479 6.313 5.979
57.479 6.313 5.979
67.479 6.813 5.813
平均值7.479 6.507 5.952
对教师的评价RSD（%） 1.41 3.40 1.14
2.2.4.2中间精密度两位实验员分别在两天对同一批三价疫苗流感病毒滴度进行3次检测，3种型别流感病毒滴度6次检测结果的RSD均小于15%，见表5。表明该方法中间精密度较好。
表5中间精密度验证结果（logCCID50／0.2ml）
Tab5.Verification for intermediate precision（logCCID50／0.2ml）
病毒型别
H1N1H3N2B
1A7.479 6.313 6.313 B7.313 6.646 5.979 2A 6.979 6.146 5.979 B7.479 6.313 5.979 3A7.146 6.479 5.979 B7.479 6.313 5.979平均值7.317 6.368 6.035 RSD（%） 2.88 2.70 2.25
2.2.5耐用性同种型别病毒在不同日进行检测，结果RSD均小于15%；与第6天检测结果相比，检测日提前或滞后1d，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。见表6。表明该方法耐用性较好。表6耐用性验证结果（logCCID50／0.2ml）
Tab6.Verification for robustness（logCCID50／0.2ml）
病毒型别
H1N1H3N2B
51 6.979 6.146 6.146
蔡徐坤为什么招全网黑2 6.81
3 6.313 5.979
37.146 6.146 5.979 61 6.979 6.313 6.313
27.146 6.146 5.979
37.479 6.479 5.979 717.146 6.313 6.146
2 6.979 6.31
3 6.146
37.479 6.479 5.979平均值7.128 6.295 6.072 RSD（%） 3.19 2.07 1.99
P10.2750.3740.678 P2 1.00.642 1.0
注：P1表示加毒后第5天与第6天各型别病毒滴度比较；P2表示加毒后第7天与第6天各型别病毒滴度比较。
3讨论
预实验结果表明，细胞接种量应控制在2.0×105个／孔，当加入细胞量过多时，会出现细胞变圆、悬浮于贴壁细胞之上的情况；细胞接种量过少，则会引起细胞脱落。这两种情况均会较大程度地影响对病变细胞孔的判断。同时在病毒生长液中加入1% HEPES可维持pH稳定在7.2左右，使细胞在检测期间维持正常状态。
流感病毒表面血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）通过与宿主细胞表面唾液酸结合而吸附于细胞上，再经吞饮作用进入细胞。宿主的胰蛋白酶可将HA 前体蛋白裂解成HA1、HA2和信号肽3部分，其中羧基端的HA2可促进病毒囊膜和细胞膜融合，进而释放出病毒核酸［8］。即HA能否被裂解成HA1和HA2成为病毒致病力的关键［9-11］。MDCK细胞不分泌胰蛋白酶，需在病毒生长液中加入TPCK-胰酶，促进病毒感染并产生明显细胞病变。本实验结果也表明，TPCK-胰酶在促进H1N1型病毒感染效
果方面较H3N2和B型更为明显。有报道表明，提高病毒生长液中胰酶浓度可增加病毒产量［12］，但本实验体系中高于1μg／ml胰酶浓度常会导致细胞脱落，影响判断，因此选用1μg／ml TPCK-胰酶浓度作为最终条件。
平行样
平行样实验员
白敬亭百度百科加毒后时间（d）平行样
（上接第977页）
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收稿日期：2016-01-12编辑：李靓
用鸡胚或细胞基质生产流感减毒活疫苗可保证在大流感暴发时短期快速生产大量流感疫苗。目前常用的采用鸡胚检测病毒滴度的方法受鸡胚来源以及前孵化条件等方面影响，波动性较大，准确性和重复性低，实验室间差异也较大，限制了其在疫苗放行、流感疫苗制剂处方研究和疫苗稳定性评价等方面的应用。本实验建立的CCID50法检测三价流感减毒活疫苗病毒滴度的方法与鸡胚法相比，具有准确度高、重复性好、灵敏度好等优点，尤其适用于对流感病毒滴度检测结果准确性要求较高的研究，如制品稳定性考察及制剂处方优化筛选等。此方法的建立对于流感减毒活疫苗在中国的上市及推广具有重要意义。
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收稿日期：2016-01-06编辑：何巍
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