(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711190257.8
(22)申请日 2017.11.24
(71)申请人 长春百克生物科技股份公司
地址 130000 吉林省长春市高新开发区火
炬路1260号
申请人 吉林大学
(72)发明人 孔维 张海红 于湘晖 陆臻桢
刘晨露 徐平 耿飞 谢雨
郭倩倩
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 温可睿 赵青朵
(51)Int.Cl.
A61K 39/00(2006.01)
A61K 39/39(2006.01)
女孩男孩一个样A61K 39/235(2006.01)A61K 39/275(2006.01)A61K 31/555(2006.01)A61P 35/00(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/861(2006.01)C12N 15/863(2006.01)C07K 19/00(2006.01) (54)发明名称
重组疫苗及其应用
(57)摘要
本发明涉及生物技术药物技术领域，
尤其涉及重组疫苗及其应用。本发明提供了分子组合，
包括可溶性PD-1、MUC1和Survivin。以该分子组
活性。本发明提供的疫苗免疫可产生针对MUC1、
Survivin的特异性抗体应答和特异性细胞免疫
应答。与DNA疫苗CpDV-IL2-MS相比，CpDV-IL2-
sPD1/MS在荷瘤小鼠中具有更显著的抗肿瘤效
应。本发明进一步提供了性疫苗与化学
药物的联合方案。权利要求书2页 说明书22页序列表10页 附图14页CN 107952069 A 2018.04.24
C N 107952069
A
1.一种分子组合，其特征在于，包括sPD-1、MUC1和Survivin。
2.根据权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述sPD-1的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述sPD-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述MUC1的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的分子组合，其特征在于，所述Survivin的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.权利要求1～4任一项所述的分子组合在制备防治肿瘤的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自黑素瘤、结直肠癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胆管癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸癌、鳞状细胞癌、淋巴瘤、脑癌、恶性胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、淋巴肉瘤、绒毛膜上皮癌、骨肉瘤、甲状腺癌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品中包括疫苗。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括sPD-1、MUC1和Survivin的DNA序列的重组载体。
无圣光9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述sPD-1为sPD-1的DNA序列的5’端修饰tPA信号肽序列。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述PD-1与tPA信号肽序列相连的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
婚纱摄影推广11.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述MUC1和Survivin连接的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
12.一种重组载体，其特征在于，包括骨架载体、SEQ ID NO:7所示的DNA序列、SEQ ID NO:8所示的DNA序列和佐剂序列。
13.根据权利要求12所述的重组载体，其特征在于，所述骨架载体为CpDV。
14.根据权利要求13所述的重组载体，其特征在于，所述佐剂序列为白介素-2，其DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
15.权利要求12～14任一项所述重组载体在制备防治肿瘤的产品中的应用。
16.一种防治肿瘤的疫苗，其特征在于，包括权利要求12～14任一项所述的重组载体。
17.根据权利要求16所述的防治肿瘤的疫苗，其特征在于，还包括PBS溶液，权利要求12～14任一项所述重组载体的浓度为0.1 mg/mL～10mg/mL。
18.权利要求16～17任一项所述疫苗的制备方法为，在骨架载体的Xba I和BamH I酶切位点之间插入佐剂序列，然后在Bgl II和EcoR I酶切位点之间插入SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列，制得重组载体后，溶解于PBS溶液。
19.一种重组载体，其特征在于，包括骨架载体、SEQ ID NO:7所示的DNA序列和SEQ ID NO:8所示的DNA序列。
20.根据权利要求19所述的重组载体，其特征在于，所述骨架载体为PET28a。
21.一种表达载体，其特征在于，由权利要求19～20任一项所述重组载体转染宿主细胞制得。
22.一种融合蛋白，其特征在于，由权利要求21所述的表达载体表达。
23.权利要求22所述的融合蛋白在制备防治肿瘤的产品中的应用。
24.一种防治肿瘤的疫苗，其特征在于，包括权利要求23所述的融合蛋白。
25.根据权利要求24所述的疫苗，其特征在于，其中还包括佐剂，所述佐剂为Al(OH)3、CpG、MPL、QS21、AS02、AS03、Poly-IC及其衍生物等。
26.一种重组载体，其特征在于，包括骨架载体、SEQ ID NO:7所示的DNA序列、SEQ ID NO:8所示的DNA序列，所述载体为pSC11或pDC316。
期货投资策略27.一种重组病毒，其特征在于，以权利要求28所述的重组载体转染细胞，在细胞内与感染的病毒发生同源重组制得，所述病毒为腺病毒或痘病毒。
28.权利要求27所述的重组病毒在制备防治肿瘤的产品中的应用。
29.一种防治肿瘤的疫苗，其特征在于，包括权利要求27所述的重组病毒。
30.一种防治肿瘤的产品，其特征在于，包括权利要求16～17任一项所述的疫苗、权利要求24～25任一项所述的疫苗和/或权利要求29所述的疫苗。
浪漫情书31.根据权利要求30所述的产品，其特征在于，其中还包括化疗药物。
32.一种防治肿瘤的产品，其特征在于，包括以MS为靶点的疫苗并且MS与sPD-1融合表达的疫苗。
33.根据权利要求32所述的产品，其特征在于，其中还包括化疗药物。
目前比较好的奶粉34.一种防治肿瘤的方法，其特征在于，给予权利要求30～33任一项所述的产品。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，给予权利要求30～33任一项所述的产品后，以活体基因导入仪刺激注射位点。
重组疫苗及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术药物技术领域，尤其涉及重组疫苗及其应用。
背景技术
[0002]癌症或恶性肿瘤是威胁人类健康的杀手，肿瘤的诱发原因错综复杂，我们至今缺乏对其具体形成机制的深刻理解。最近的研究表明，机体免疫系统与肿瘤细胞间存在循环相互作用，即免疫系统能够识别“非我”成分的癌细胞，癌细胞也能通过多种途径逃避机体免疫系统的监控和攻击，造成患者体内肿瘤细胞的扩散转移。肿瘤免疫逃逸的分子机制包括：肿瘤抗原表达下调或丢失，肿瘤细胞分泌具有免疫抑制功能的可溶性细胞因子，肿瘤微环境招募免疫抑制性淋巴细胞，以及肿瘤细胞上调表达负性协同刺激信号等。其中，在肿瘤局部微环境及干扰素γ等细胞因子的诱导下，活化的T细胞上大量表达负性共刺激分子，这些免疫抑制调控分子将直接影响效应细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤活性，使其杀伤功能减弱甚至丧失。目前发现的抑制性协同刺激分子主要有CTLA4/CD80(CD86)、PD1/PD-L1 (PD-L2)、BTLA/HVEM、TIM3/GAL9等。
[0003]人程序性细胞死亡蛋白1(Programmed Death-1,PD-1)又名CD279，它与两个配体PD-L1(B7H1,CD274)和PD-L2(B7DC,CD273)同属免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，由胞浆区、跨膜锚定区和胞外位点结合域三部分构成。介导PD-1信号免疫抑制功能的关键结构，是位于胞内信号转导区的免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptortyrosine-based switch motif，ITSM)，当配受体偶联时，ITSM基序启动酪氨酸磷酸化程序以招募相关磷酸酶，使下游的信号通路PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)去磷酸化，从而导致细胞因子合成的中断和T细胞效应不敏感等。PD-1/PD-L
1信号通路在正常组织器官及外周淋巴组织低表达或诱导性表达，对维持机体免疫耐受、防止自身免疫病的发生具重要意义；而肿瘤部位PD-1分子的高表达，则加速了活化T细胞的凋亡。
[0004]2013年，科学杂志授予免疫检查点阻断疗法年度重大科学突破，免疫也真正使人们看到治愈癌症的希望。免疫检查点阻断疗法(Immune Checkpoint Blockade)即应用抑制剂阻断负性调节T细胞的共抑制信号通路，解除T细胞抑制并重新释放其免疫活性。当前开发的抑制剂主要是人源化单克隆抗体，分别阻断两个重要的免疫检查点——细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA4)和PD-1。2014年，Herbst等报导一种能有效阻断PD-1配体PD-L1的单抗药物PMDL3280A65例化药无效的膀胱癌患者，结果30例PD-L1阳性患者中有13例(43％)产生明显的抑瘤肿瘤的效应，其中2人达到病情完全缓解；另外，在PD-L1阴性患者中也有11％的应答率。由此，体现出检查点阻断药物的抗肿瘤免疫应答优势，为癌症免疫提供了新的研究思路。与此同时，单抗类抑制剂也存在一些弊端使得药物临床应用受到限制。例如，部分患者的肿瘤组织免疫组化检测显示没有T淋巴细胞浸润现象，可能导致此部分患者单抗无效；也有一些患者在接受抗CTLA4抗体后，出现致命的自身免疫病相关的不良反应；此外，人源化单克隆抗体制作成本较高，用药费用昂贵。这些问题都说明检查点阻断需建立更加完善的适应症者筛选程序和方案，而目前开发的PD-1
抗体形式阻断剂则无法引导抗肿瘤主动免疫，其阻断剂形式尚待进一步优化。文献资料显示，一种可溶型PD-1(sPD-1)蛋白可与配体PD-L1识别并结合，可作为另一PD-1/PD-L1信号通路阻断剂的形式应
用于抗肿瘤免疫。
[0005](1)可溶性PD-1分子的生物学特性
[0006]共刺激蛋白通常存在两种形式：锚定于细胞膜上或分泌到胞外，可溶型分子保留了膜型分子的胞外配受体结合域，以游离方式通过血液循环作用于远端效应分子，参与调节机体免疫。现已证实，天然的人PD-1分子包含上述两种蛋白形式，且膜型与可溶型PD-1 (Soluble PD-1，sPD1)皆由PDCD1基因编码，其中，所编码的全长mRNA翻译产物为膜型分子，而一种缺失外显子3的mRNA剪接变异体则直接翻译成sPD1。sPD1形成的另一种方式，可能是膜型PD-1在蛋白水解酶作用下脱落产生。sPD-1的IgV-IgC样结构，介导与配体PD-L1和PD-L2的结合，但由于缺乏胞内抑制基序，无法启动下游免疫抑制信号。Wan等检测类风湿性关节炎患者的关节滑液及外周血中都有sPD1分子的高表达，同时伴随IFN-γ、IL-4、IL-21等T 细胞活化相关细胞因子水平升高。
[0007]人与小鼠PD-1和PD-L1蛋白的同源性分别达60％和70％，并且胞外结合关键位点的一级序列高度保守。体外试验结果表明重组人sPD1融合蛋白与小鼠的PD-L1、PD-L2有交叉结合作用，说明人源sPD-1也能阻断小鼠PD-1抑制信号通路。
[0008](2)可溶型PD-1的生理功能
[0009]可溶型协同刺激分子参与调节机体免疫的相关研究，包括有sCD80、sLAG3、sPD1和sBTLA等，这些分子在病毒感染、肿瘤和自身免疫病等中有各自的生理功能。sPD1分子的免疫调节作用具体表现在四个方面：①是促进T淋巴细胞上一些激活型细胞因子的分泌(IFN-γ、IL-2等)，同时减少抑制型因子IL-10和TGF-β；②sPD1作用能促进特异性CD4阳性和CD8阳性T细胞的增殖，并且活化的T细胞上调抑凋亡基因Bcl-xl的表达，使T细胞凋亡活性减弱；③流式检测sPD1分子对DC细胞的影响，观察到CD80、CD86、IL-12及MHC-II类分子荧光强度均有显著提升，表明可溶性PD-1能够促进DC细胞的成熟；④sPD-1可通过有靶向DC而促进CD8+T细胞的功能。有关于sPD1分子激活机体免疫的具体分子机制尚待研究，但我们认为其生理功能的发挥有赖于抗原特异性细胞免疫应答，单独的sPD1分子是不具备特异性免疫效应的。
[0010](3)可溶型PD-1在抗肿瘤免疫中的应用
[0011]可溶性PD1分子作为一种形式的PD-1通路阻断剂，已有一定的临床前应用基础。Shin等，以疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)为靶点，构建了携载重组HSVtk基因和重组可溶性sPD1-Ig基因双顺反子的条件复制型腺病毒载体。将此双基因联合腺病毒进行瘤内注射，基因结直肠癌肿瘤模型小鼠。结果显示，联合组抑瘤效果达90％，与单一的HSVtk相比有良好的协同效果；而单独的sPD1基因组，则没有任何抗肿瘤作用；当删除小鼠体内CD8阳性T细胞后，sPD1的协同抗瘤作用消失。
[0012]癌症的免疫中，Chen等考察了模式性sPD-1-p24抗原融合核酸疫苗对表达异种抗原GAG的恶性间皮细胞瘤的抑瘤效果。肌肉接种sPD1-p24DNA疫苗的荷瘤小鼠，生存期达到100％，八个月后检测小鼠的特异性体液免疫和细胞免疫，结果IgG1/IgG2a及特异性CD8+T细胞数，都依然维持在高水平，体现了sPD-1抗肿瘤免疫应答是长效性。进一步研究发现，sPD-1能激发IFN-γ/TNF-α双阳T细胞的大量扩增，帮助T细胞杀伤肿瘤。另外，sPD1-p24
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