新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）
2⽉6⽇，国家卫⽣健康委发布了新型冠状病毒感染的肺炎防控⽅案（第四版），同时作为附件发布了新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）。
为指导各级疾控部门和其他相关机构开展新型冠状病毒肺炎实验室检测⼯作，特制定本技术指南。
本指南主要介绍⽬前已经⽐较成熟、易于实施的核酸检测⽅法。
（⼀）采集对象。
新型冠状病毒肺炎疑似病例、临床诊断病例（仅限湖北省）和聚集性病例，其他需要进⾏新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进⼀步筛查检测的环境或⽣物材料（如溯源分析）。
(⼆)标本采集要求。
1.从事新型冠状病毒检测标本采集的技术⼈员应经过⽣物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。
采样⼈员个⼈防护装备（personal protective equipment，PPE）要求：
N95 及以上防护⼝罩、护⽬镜、连体防护服、双层乳胶⼿套、防⽔靴套；
如果接触了患者⾎液、体液、分泌物或排泄物，应及时更换外层乳胶⼿套。
2.住院病例的标本由所在医院的医护⼈员采集。
3.密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。
4．根据实验室检测⼯作的需要，可结合病程多次采样。
（三）标本采集种类。
每个病例必须采集急性期呼吸道标本（包括上呼吸道标本和下呼吸道标本）；
重症病例优先采集下呼吸道标本（如⽀⽓管或肺泡灌洗液等）；赘婿宁毅登基后谁是皇帝
出现眼部感染症状的病例，需采集眼结膜拭⼦标本；
出现腹泻症状的病例，需留取便标本。
可根据临床表现与采样时间间隔进⾏采集。尾京介
其他研究材料依据设计需求采集。
标本种类：
1．上呼吸道标本：
包括咽拭⼦、⿐拭⼦、⿐咽抽取物等。
2．下呼吸道标本：
包括深咳痰液、呼吸道抽取物、⽀⽓管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。
3．⾎液标本：
尽量⾤集发病后7天内的急性期抗凝⾎。
采集量5ml，以空腹⾎为佳，建议使⽤含有EDTA抗凝剂的真空⾤⾎管采集⾎液。
4.⾎清标本：
尽量⾤集急性期、恢复期双份⾎清。
第⼀份⾎清应尽早（最好在发病后7天内）⾤集，第⼆份⾎清应在发病后第3～4周⾤集。
采集量5ml，建议使⽤⽆抗凝剂的真空⾤⾎管。
⾎清标本主要⽤于抗体的测定，从⾎清抗体⽔平对病例的感染状况进⾏确认。⾎清标本不进⾏核酸检测。
5．眼结膜标本：出现眼部感染症状的病例需采集眼结膜拭
⼦标本。
6．便标本：
出现腹泻症状的患者需采集便标本。
（四）标本采集⽅法。
1．咽拭⼦：
⽤2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭⼦同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭⼦头浸⼊含3ml病毒保存液（也可使⽤等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液）的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
2．⿐拭⼦：
将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭⼦轻轻插⼊⿐道内⿐腭处，停留⽚刻后缓慢转动退出。
取另⼀根聚丙烯纤维头的塑料杆拭⼦以同样的⽅法采集另⼀侧⿐孔。
上述两根拭⼦浸⼊同⼀含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
3．⿐咽抽取物或呼吸道抽取物：
⽤与负压泵相连的收集器从⿐咽部抽取粘液或从⽓管抽取呼吸道分泌物。
将收集器头部插⼊⿐腔或⽓管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并⽤3ml采样液冲洗收集器1次（亦可⽤⼩⼉导尿管接在50ml注射器上来替代收集器）。
4．深咳痰液：
要求病⼈深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml 采样液的50ml螺⼝塑料管中。
5．⽀⽓管灌洗液：
将收集器头部从⿐孔或⽓管插⼝处插⼊⽓管（约30cm深处），注⼊5ml⽣理盐⽔，接通负压，旋转收集
器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并⽤采样液冲洗收集器1 次（亦可⽤⼩⼉导尿管接在50ml注射器上来替代收集）。
6．肺泡灌洗液：
局部⿇醉后将纤维⽀⽓管镜通过⼝或⿐经过咽部插⼊右肺中叶或左肺⾆段的⽀管，将其顶端契⼊⽀⽓管分⽀开⼝，经⽓管活检孔缓缓加⼊灭菌⽣理盐⽔，每次30～50 ml，总量100～250ml，不应超过300ml。
7．⾎液标本：
建议使⽤含有EDTA抗凝剂的真空⾤⾎管采集⾎液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离⼼10分钟，分别收集⾎浆和⾎液中细胞于⽆菌螺⼝塑料管中。
8.⾎清标本：
⽤真空负压采⾎管采集⾎液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离⼼10分钟，收集⾎清于⽆菌螺⼝塑料管中。
9．粪便标本：
如患者发病早期出现腹泻症状，则留取粪便标本3-5ml；
10．眼结膜拭⼦标本：
眼结膜表⾯⽤拭⼦轻轻擦拭后，将拭⼦头进⼊采样管中，尾部弃去，悬紧管盖。
其他材料：依据设计需求规范采集。
（五）标本包装。
标本采集后在⽣物安全⼆级实验室⽣物安全柜内分装。
1．所有标本应放在⼤⼩适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的样本采集管⾥，拧紧。
容器外注明样本编号、种类、姓名及采样⽇期。
2．将密闭后的标本放⼊⼤⼩合适的塑料袋内密封，每袋装⼀份标本。
样本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准。
3. 涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照A类或B类感染性物质进⾏三层包装。
（六）标本保存。
⽤于病毒分离和核酸检测的标本应尽快进⾏检测，能在24 ⼩时内检测的标本可置于4℃保存；
24⼩时内⽆法检测的标本则应置于-70℃或以下保存（如⽆-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存）。
⾎清可在4℃存放3天，-20℃以下可长期保存。
应设⽴专库或专柜单独保存标本。机动车违法查询
应设⽴专库或专柜单独保存标本。
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标本运送期间应避免反复冻融。
（七）标本送检。
标本采集后应尽快送往实验室，如果需要长途运输标本，建议采⽤⼲冰等制冷⽅式进⾏保藏。
1．上送标本。
各省（⾃治区、直辖市）聚集性病例的标本，上送中国疾
病预防控制中⼼病毒病预防控制所进⾏检测复核，并附样本送检单（见附件）。
2．病原体及标本运输。
2.1 国内运输。
新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性⽣物材料的运输包装
分类属于A类，对应的联合国编号为UN2814，包装符合国际民航
组织⽂件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI602分类包装要求；
环境样本属于B类，对应的联合国编号为UN3373，包装符合国际民航组织⽂件Doc9284《危险品航空安全运输技术细则》的PI650分类包装要求；
通过其他交通⼯具运输的可参照以上标准包装。
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新型冠状病毒毒株或其他潜在感染性材料运输应按照《可感染⼈类的⾼致病性病原微⽣物菌（毒）种或样本运输管理规定》（原卫⽣部令第45号）办理《准运证书》。
2.2 国际运输。
新型冠状病毒毒株或样本在国际间运输的，应规范包装，
降准什么意思按照《出⼊境特殊物品卫⽣检疫管理规定》办理相关⼿续，并满⾜相关国家和国际相关要求。
2.3 毒株和样本管理。
新型冠状病毒毒株及其样本应由专⼈管理，准确记录毒株
和样本的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和样本的安全，严防发⽣⽆⽤、恶意使⽤、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。
⼆、新型冠状病毒的实验室检测
新型冠状病毒感染的常规检测⽅法是通过实时荧光RT-PCR 鉴定。
任何新型冠状病毒的检测都必须在具备适当条件的实验室由经过相关技术安全培训的⼈员进⾏操作。
本指南中的核酸检测⽅法主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ）和核壳蛋⽩（ nucleocapsid protein，N）。
在实验室要确认⼀个病例为阳性，满⾜以下条件：
在实验室要确认⼀个病例为阳性，满⾜以下条件：
同⼀份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。
阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产⽣假阴性的因素，包括：
样本质量差，⽐如⼝咽等部位的呼吸道样本；
样本收集的过早或过晚；
没有正确的保存、运输和处理样本；
技术本⾝存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。
三、实时荧光 RT-PCR ⽅法检测新型冠状病毒核酸
（⼀）⽬的。
规范实时荧光RT-PCR⽅法检测新型冠状病毒核酸的⼯作程序，保证实验结果的正确可靠。
（⼆）范围。
适⽤于实时荧光RT-PCR⽅法检测新型冠状病毒核酸。
（三）职责。
检测⼈员：负责按照本检测细则对被检样本进⾏检测。
复核⼈员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进⾏复核。
部门负责⼈：负责对科室综合管理和检测报告的审核。
（四）样本接收和准备。
核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项⽬等；
待检样本的状态如有异常，需注明；
待检样本应存放于-70℃冰箱保存。
（五）检测项⽬。
1.新型冠状病毒核酸测定（实时荧光RT-PCR⽅法）推荐选⽤针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和
探针。
靶标⼀（ORF1ab）:
正向引物（F）：
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：
ACGATTGTGCATCAGCTGA