藿香正气水是由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、广藿香油、紫苏叶油等提取配制而成，具有解表化湿、理气和中的作用，用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒、胃肠型感冒等症[1]。自新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）爆发以来，中药发挥了不可或缺的作用，其中藿香正气系列中成药是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》中医学观察期表现为乏力伴胃肠不适者的推荐用药，现已在抗疫一线初显成效[2-3]。
经查证，在国家药品监督管理局备案的藿香正气水产品共有162条记录，且不同藿香正气水产品价格也有很大差异，同规格的产品价格差异可达20倍之多。有文献[4-6]表明，不同厂家的藿香正气水产品质量差异较大。经查询国家药品监督管理局，近5年，就有87条藿香正气水违规查处记录，是中成药中的常见风险监控项目。目前，有些厂家为了降低生产成本，采用质量较差的原材料，或以设备简陋、索价低廉的小厂代为提取浓缩[7]，这导致了不同厂家藿香正气水的质量差异，从而直接影响了其临床使用中的药物有效性。因此，对藿香正气水进行成分鉴别和成分功效评价，在提高其药物有效性方面具有重大意义。
汤芳人体照中药指纹图谱是我国广为接受的中药质量评价方法，可以直观地揭示中药化学特征，从化学信息的角度评价中药质量，用于筛选能够真实反映产品内在品质的标志物[8-11]。目前对于藿香正气水指纹图谱的建立和质量评价研究，主要集中在气相和液相谱指纹图谱，通过标示藿香正气水特征的共有峰图谱，以评价其均一性和稳定性。例如聂黎行等[12]建立了13个厂家的28批藿香正气水的UPLC指纹图谱，确定了18个共有峰，并采用层次聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）方法，对指纹图谱进行了模式识别；李红梅等[13]建立了10批藿香正气水气相谱指纹图谱，确定了16个共有峰。然而液相谱和气相谱指纹图谱存在一定的片面性，尚无法实现更为完整全面的质量评价及鉴别目的，且对共有峰的指认较困难。
形容人的贬义词超高效液相谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS）将具有高分离度、高灵敏度的液相谱系统，与能同时提供母离子和碎片离子准确质量数以及元素组成的高分辨质谱有机结合，通过建立指纹图谱，可快速分析和表征中药材复杂成分[14-15]。分子对接技术以结构分子生物学和计算机辅助药物设计相结合的方式，通过将配体与受体进行对接，评价其对接体系的稳定性，筛选与受体活性部位空间和电性特征相匹配的小分子化合物，具有周期短、操作性强等优势，已经逐渐成为中药活性成分筛选的重要手段，广泛应用于
中药质量标志物（quality markers，Q-Marker）的筛选过程中[16-19]。
有研究表明，藿香正气水中的主要成分包括橙皮苷、甘草酸、欧前胡素、厚朴酚等[5]。其中橙皮苷[20]和甘草酸[21]与新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，Mpro）具有较好的结合亲和力，从而对SARS-CoV-2产生一定的抑制作用。
因此，为进一步对藿香正气水进行质量评价，明确不同生产厂家藿香正气水的共有物质基础和潜在Q-Marker，提高其质量控制水平，本研究以25个厂家共计27批藿香正气水作为研究对象，建立了藿香正气水的UPLC-Q-TOF-MS指纹图谱，标定了其共有峰并进行化合物表征，通过相似度评价结合HCA和PCA等模式识别方法评价不同厂家的藿香正气水差异性；并选用SARS-CoV-2 Mpro为筛选靶标，与藿香正气水的差异性成分进行分子对接获得抗SARS-CoV-2的潜在活性成分，进一步确定藿香正气水的潜在Q-Marker，为藿香正气水质量评价和有效控制提供科学依据。
结果与分析
指纹图谱建立
将27批藿香正气水样品的BPI谱图以cdf格式导入“中药谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行分析，以S1样品谱图为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，进行多点校正后自动峰匹配，其指纹图谱叠加见图1，共确定27个共有峰，以中位数法生成对照指纹图谱（图R）。各样品的相似度分布在0.790～0.984，表明27批HZS样品质量存在一定的差异性。
主要共有峰鉴定
使用UNIFI软件对27批藿香正气水样品的MSE原始数据进行处理。进行峰识别和对齐后，得到包含母离子质荷比m/z、保留时间RT和离子响应强度的数据矩阵，结合UNIFI软件自带的中药数据库及Chemical Book等线上数据库对“3.1”项中确定的27个共有峰进行鉴定，推断出14种化合物（表3），其中5种化合物经过对照品进行比对验证，1（槟榔次碱）号峰来源于大腹皮，6（甘草苷）、8（新甘草苷）、18（甘草酸）号峰来源于甘草，9（橙皮苷）、15（甜橙素）、19（川陈皮素）、20（3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮，3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone，HMOF）、21（桔皮素）号峰来源于陈皮，13（氧化前胡素）、14（新比克白芷内脂）、22（欧前胡素）、23（珊瑚菜素）号峰来源于白芷，24（厚朴酚）号峰来源于厚朴。
HCA
将得到的27个共有峰的峰面积数据导入IBM SPSS Statistics 21.0软件中，运用ward法，以平方欧氏（Euclidean）距离为测度，进行HCA，结果如图2所示。当平方Euclidean距离为5时，各样品聚类效果最好，27批藿香正气水样品可分为3类，S7、S11～S13、S15～S17、S21～S23、S25、S27聚为一类，S3、S5、S6、S8～S10、S14、S18～S20、S24、S26聚为一类，S1、S2和S4聚为一类。
PCA
应用EZInfo 3.0软件对正离子模式下各藿香正气水样品的UPLC-Q-TOF-MS原始数据进行PCA，图3为其PCA得分图。结果显示，各藿香正气水样品分为3类，S7、S10～S13、S15～S17、S21、S22、S27为一类，S6、S8、S9、S14、S18～S20、S23～S26为一类，S1～S5为一类。除S3、S5、S10、S23、S25样品外，其他样品的PCA结果与“3.3”项HCA结果一致。
通过载荷散点图进一步对影响藿香正气水质量的化学成分进行比较和分析。在载荷散点图
关于母亲节的演讲稿中的各个点表示各个质荷比-保留时间变量，根据变量离原点的距离判定变量对主成分的权重影响，离原点越远则表明该变量对主成分的影响权重越大[37]。图4为各藿香正气水样品27个共有峰的PCA载荷散点图，可以看出9（橙皮苷）、18（甘草酸）、20（HMOF）、21（桔皮素）、26号峰对主成分1的贡献率较大，10、13（氧化前胡素）、14（新比克白芷内脂）、15（甜橙素）、16、17、22（欧前胡素）、23（珊瑚菜素）、25号峰对主成分2的贡献较大，说明以上14种化合物在27批藿香正气水样品中的相对含量存在较大差异，是藿香正气水的差异性成分。
潜在Q-Marker的确定
以药物瑞德西韦为阳性对照，以藿香正气水 9种已鉴定出的差异性成分橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷内脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、欧前胡素、珊瑚菜素作为研究对象，分别与SARS-CoV-2Mpro进行对接，以结合能大小、结合位点等作为评价指标，筛选出对SARS-CoV-2 Mpro可能有抑制作用的HZS潜在活性成分，作为藿香正气水的潜在Q-Marker。阳性对照和9种差异性成分与SARS-CoV-2 Mpro的对接结果如表4所示。
由表4可知，瑞德西韦与SARS-CoV-2 Mpro的结合能为周文雍−28.88 kJ/mol，差异性成分中橙皮
苷、氧化前胡素、新比克白芷内脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、欧前胡素、珊瑚菜素与SARS-CoV-2 Mpro的结合能分别为−36.84、−26.37、−28.46、−飞轮海成员图片26.37、−38.09、−25.53、−26.37、−28.04、−28.46 kJ/mol，可见这9种差异性成分与SARS-CoV-2 Mpro结合能接近于阳性对照与SARS-CoV-2 Mpro的结合能。
有文献显示，复合物的稳定性主要由配体和受体之间形成的氢键和疏水键等作用力大小决定，形成的作用力越多，配体与受体结合的稳定性越高[38-39]。由表4可知，瑞德西韦与SARS-CoV-2 Mpro结合，形成2个氢键和13个疏水键，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷内脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、欧前胡素、珊瑚菜素与SARS-CoV-2 Mpro结合分别形成了9、2、3、3、8、3、3、1、1个氢键和9、8、7、7、8、6、6、8、7个疏水键，这可能是这9种化合物与SARS-CoV-2 Mpro的结合能小于或者较为接近瑞德西韦的原因。
据文献报道[40]，SARS-CoV-2 Mpro具有S1（Phe140、Leu141、His163、Met165、Glu166、His172）、S2（Met49、Asp187、Gln189）、S1’（Thr25、Leu27、Cys38、P
ro39、Val42、Cys145）、S2’（Thr26、Asn28、Tyr118、Asn119、Gly143）和S4（Leu167、Gln192）5个活性口袋，配体通常需要与靶蛋白的关键活性氨基酸残基结合，才能有效抑制其活性[41]。
从结合位点角度分析，瑞德西韦位于SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4中（图5），且与S1的活性氨基酸残基Phe140结合形成1个氢键，与S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸残基Thr26、Thr25、Gly143、Cys145、His163、Leu141、Glu166、Met165、Gln189、Met49结合形成10个疏水键（表4和图6-S1、S2、S1’、S2’和S4中（图5），橙皮苷与S1、S1’、S2’的活性氨基酸残基Glu166、Cys145、Thr26结合形成4个氢键，与S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸残基Met49、Gln189、His163、Leu141、Gly143、Thr25结合形成6个疏水键（表4和图6-B）；氧化前胡素与S1、S1’的活性氨基酸残基Glu166、Cys145结合形成2个氢键，与S1、S2、S1’、S2’活性氨基酸残基Met165、Met49、Thr25、Leu27、Gly143、His163结合形成6个疏水键（表4和图6-C）。
此外，还有文献报道[42-43]，Thr24、His41、Cys44、Thr45、Ser46、Asn142、Ser144、His164、Pro168、Arg188、Thr190、Thr111、Thr292、Phe294、Gln110、Asp
153、Gln107、Ile249、His246等也是SARS-CoV-2 Mpro的活性氨基酸残基，可形成SARS-CoV-2 Mpro的活性口袋S5（图7）。
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