作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(10): 2475 2482 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由国家重点研发计划项目(2019YFD1001300, 2019YFD1001303)和财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系项目(食用豆, CARS-08)资助。
This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2019YFD1001300, 2019YFD1001303) and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Food Legume, CARS-08).
*
通信作者(Corresponding authors): 王丽侠,E-mail:*******************；熊涛,E-mail:********************
第一作者:E-mail:*****************
Received (收稿日期): 2021-10-15; Accepted (接受日期): 2022-01-05; Published online (网络出版日期): 2022-02-23. URL: knski/kcms/detail/11.1809.S.20220223.1023.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.14187
李建领1,2 公 丹2,3 王素华2 陈红霖2 程须珍2 熊 涛1,* 王丽侠2,*
1
长江大学生命科学学院, 湖北荆州 434025; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 3 长江大学农学院, 湖北荆州 434025
摘 要: 为促进豇豆种质资源的高效利用和新基因发掘, 本研究基于豇豆F 2体, 利用重测序技术构建了包含2984个bin 标记(142,146个SNP)的遗传连锁图谱。该图谱共11个连锁, 总长1333.48 cM, 平均图距0.45 cM 。不同连锁的长度从84.63~183.15 cM 不等, 平均图距从0.27 cM 至0.89 cM 不等。根据F 2、F 3的表型调查, 利用该图谱共检测到15个QTL, 分别与百粒重、花、荚长、荚形、荚质、籽粒颜等14个性状相关。其中荚质、荚长、主茎分枝数等分别检测到1个主效QTL 区间, 其余性状检测到多个QTL 区间。通过对区间内的基因注释分析, 分别确定了与荚长、单株荚数、籽粒颜构成等性状相关的候选基因。本研究中QTL 分析结果将为豇豆属重要性状的标记辅助选择奠定基础, 而候选基因筛选则有助于深入解析这些性状的遗传机理, 提高豇豆分子遗传学研究水平。 关键词: 豇豆; SNP; 遗传图谱; 农艺性状; QTL 定位
Construction of SNP high-density genetic map and QTL analysis of agronomic traits in cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.)
LI Jian-Ling 1,2, GONG Dan 2,3, WANG Su-Hua 2, CHEN Hong-Lin 2, CHENG Xu-Zhen 2, XIONG Tao 1,*, and WANG Li-Xia 2,*
1
College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China; 3 School of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China
Abstract: To promote efficient utilization of cowpea germplasm resources and new gene discovery, a genetic linkage map con-taining 2984 Bin markers (142,146 SNPs) was constructed based on cowpea F 2 population using re-sequencing technology. The map consisted of 11 linkage groups with a total length of 1333.48 cM and an average map spacing of 0.45 cM. The length of dif-ferent linkage groups ranged from 84.63 cM to 183.15 cM, and the average plot distance ranged from 0.27 cM to 0.89 cM. A total of 15 QTLs were detected to be associated with 14 traits, including 100-grain
weight, flower color, pod length, pod shape, pod shape and grain color, respectively. One major QTL region was detected for pod type, pod length, and number of branches per main stem, and multiple QTLs regions were detected for other traits. Candidate genes related to pod length, number of pods per plant, and single/double color of grains were further identified by gene annotation analysis in the interval. The results of QTL analysis in this study will lay a foundation for marker-assisted selection of important traits of cowpea, and candidate gene screening will help to further analyze the genetic mechanism of these traits and improve the level of molecular genetics research of cowpea. Keywords: cowpea; SNP; genetic map; agronomic traits; QTL mapping
豇豆(Vigna unguiculata (Linn.) Walp.)是二倍体植物(2n =2x =22), 起源于非洲, 基因组大小约587 Mb [1-2]。豇豆可分为普通豇豆(Vigna unguiculata )、短荚豇豆(Vigna unguiculata subsp. cylindrica )、长豇
豆(Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis (L.) Verdc.) 3个亚种。普通豇豆一般食用干籽粒, 矮生直立, 主要分布在非洲等干旱半干旱国家和地区; 短荚豇豆主要分布在东南亚, 以饲用或食用为主; 长豇豆主
2476作物学报第48卷
要是菜用, 全球各国均匀分布。豇豆既可为人类提供优质植物蛋白质及多种维生素、微量元素, 也富含多酚等功能因子, 具有一定医疗保健作用[3]。随着气候变迁, 干旱、冰雹等自然灾害频发, 豇豆尤其是普通豇豆因生育期短、耐旱耐瘠薄等, 在救灾补种、填闲垦荒等方面具有不可替代的作用, 产业发展前景广阔。然而作为小宗作物, 豇豆遗传研究相对滞后, 育种进程缓慢, 难以有效满足生产及市场需求。开展其分子遗传学研究, 可有助于提高新基因发掘效率, 促进现代生物技术在育种中的利用。
遗传图谱构建和基因定位是分子遗传学研究的基础。早期的豇豆连锁图谱主要基于RFLP[4]、RAPD[5]或EST[6-7]等标记构建, 这些标记类型因数量有限, 图谱密度较低。随着高通量测序技术的发展及豇豆全基因序列的公开[2], 先后有以DArT[8]、SNP[9-10]等标记构建高密度遗传图谱的报道, 并陆续开展了包括荚长等产量相关性状[8-10]及开花期等驯化性状[10-12]的QTL定位分析, 一定程度上促进了豇豆分子遗传学研究。虽然SNP标记数量多, 多态性高, 但受检测技术所限, 其共享性较低。因此, 本研究基于普通豇豆和长豇豆衍生的F2体, 也构建了高密度SNP遗传图谱, 并依据F2、F3单株荚数、百粒重等14个性状的表型数据, 开展了QTL分析和候选基因筛选, 为重要性状标记辅助选择及遗传机制解析等奠定了基础。1材料与方法
1.1试验材料及表型数据调查
试验材料为包含193个家系的F2、F3体, 其亲本分别是来自印度的有限生长习性的普通豇豆‘PGIP14’
和国内无限生长习性的长豇豆品种‘优冠’, 双亲间性状差异较大(表1)。F2体各单株及双亲于2020年冬季在海南三亚种植, 株距15 cm, 行距40 cm, 在幼苗期取双亲及F2单株的新鲜叶片用于DNA提取[13]。2021年每F2单株及双亲分别取健康饱满的种子, 继续在北京加代繁殖, 株距20 cm, 行距50 cm。
分别调查F2单株(三亚)及F3家系各10个单株(北京)的花、荚形、荚质、荚、荚长、成熟期、主茎分枝数、百粒重、单株荚数、单荚粒数、粒、籽粒颜构成、脐环有无、籽粒分布密度14个农艺性状。其中籽粒颜构成可目测分为单、双。籽粒分布密度为荚长与单荚粒数的比值。其余性状的数据采集参考《豇豆种质资源描述规范和数据标准》[14]。
1.2基因组重测序及数据处理
DNA提取及文库构建、测序等均按照Illumina 公司提供的标准执行[15]。简述如下: DNA质量合格后, 用超声破碎将DNA随机打断, 片段经末端修复、3'端加A、加测序接头、纯化、PCR扩增等完
表1用于豇豆作图体的亲本性状
Table 1 Parental traits for cowpea mapping population
亲本 Parent
质量性状
Quality trait PGIP14 优冠 Youguan 标准差
SD
显著性差异检测
Significant test
荚质Pod type 硬荚Hard pod 软荚Soft pod — —
籽粒颜构成Type of seed color 单Single 单Single —
— 花Flower color 白White 紫Purple —
— 脐环有无Presence or absence of hilum color 有Present 无Absent —
—
粒Seed color 白White 红Red —
— 荚形Pod shape 圆筒形Cylinder长圆条形Long cylinder— —
荚 Pod color 紫Purple 绿Green — —
荚长Pod length 14 73 29.5**P < 0.01
主茎分枝数Number of branches per stem 6 12 3*P < 0.05
单株荚数Number of pods per plant 16 21 2.5*P < 0.05
单荚粒数Number of seeds per pod 12 16 2 P > 0.05
籽粒分布密度Seed density 0.86 0.22 0.32*P < 0.05
百粒重Hundred-grain weight 18 30 6*P < 0.05
*、**表示在0.05和0.01水平上显著差异。
* and ** mean significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
第10期
李建领等: 豇豆SNP 高密度遗传图谱构建及重要农艺性状QTL 定位 2477小生意做什么好
成测序文库构建。文库质检合格后通过Illumina 平台测序。为保证后续信息分析的准确性, 原始序列经质量过滤后, 通过BWA 软件比对定位到参考基因组并进行变异检测和分析。
1.3 高密度遗传图谱的构建
1.3.1 标记分型及Bin 划分 为保证图谱质量, SNP 标记筛选原则为: 亲本内纯合, 且亲本间不一致; 标记深度不低于10X, 且能定位到染体。筛选后的SNP, 15个为1个窗口, 1个为步长在染体上滑动扫描, 当滑窗内的SNP 分型为aa 的数目大于等于13个时分型为aa, 当滑窗内的SNP 分型为bb 的数目大于等于13个时分型为bb, 其他则以ab 进行基因型填补和校正, 然后根据子代重组情况进行Bin 划分。各样本按染体物理位置排列整齐, 当任何样本中出现分型转变就认为出现重组断点, 将重组断点间的SNP 划入Bin, Bin 内没有重组发生。 1.3.2 Bin 标记筛选及图谱构建 上述Bin 标记中长度不足20 kb 及严重偏分离(卡方检验P <0.01)均过滤删除后, 以染体为单位, 采用HighMap [16]分析同一染体的Bin 标记间的连锁情况, 并估算遗传距离。 1.4 QTL 定位及筛选候选基因
1.4.1 QTL 定位 用QTL IciMapping 4.1采用完备区间作图法对农艺性状进行QTL 分析, LOD 值设置3, 作图步长设置为0.1 cM, PIN 设置为0.001[17]。
1.4.2 筛选候选基因 利用定位区间所对应的物理位置, 在NCBI 数据库豇豆参考基因组到对应区间, 分析区间内的SNP 变异, 筛选具非同义突变SNP 位点的基因, 结合功能注释筛选候选基因。
1.5 统计分析
由SPSS (www.spssau/)完成卡方检验、正态分布分析等数据统计。
2 结果与分析
四月节日2.1 后代体农艺性状
在后代体中, 花的变异主要有紫和白2种类型, 其中在F 3家系中还出现少许淡紫花; 籽粒颜构成既有单, 也有双, 单中有深系如黑、黑红等, 及浅系如白、黄白、浅红等, 变异类型丰富(表2)。
从数量性状来看, F 2、F 3体的变异类型均比较丰富。其中, 在F 2体中, 单株荚数的变异范围从2~26不等, 变异系数最高, 为45.89%; 其次是籽粒分布密度, 变异范围从0.13~0.90不等, 变异系数为34.40%; 这两个性状在F 3家系中的变异系数也最高, 分别为48.4%、35.9%。荚长、主茎分枝数、单荚粒数的变异系数比较相近, 虽然百粒重的变异系数最低, 但其变异范围分别为11.3~31.1 (F 2)及11.4~28.5 (F 3)不等, 籽粒大小相差近3倍(表3)。
表2 豇豆F 2、F 3体质量性状的分布频率
Table 2 Frequency of Distribution on quality traits in F 2 and F 3 populations of cowpea
分布频率Frequency of distribution (%)
性状 Quality trait
变异类型 Variation types F 2 F 3 硬荚Hard pod 92.7 44.3 荚质Pod type
软荚Soft pod
7.3
55.7
单Single 79.2 37.5
双Double 20.8 14.1 籽粒颜构成Type of seed color
杂合Heterozygous 48.4
紫Purple 75.5 38.5
白White 24.5 18.2 花Flower color
孔夫子搬家一一歇后语浅紫Light purple
43.2
有Present 39.6 75.5
脐环有无Presence or absence of hilum color
无Absent 60.4 24.5
深系Dark color 76.0 72.4 粒Seed color
浅系Light color
24.0
27.6
圆筒形Cylinder 40.6 7.3 长圆筒形Long cylinder
59.4
45.8
荚形Pod shape
杂合Heterozygous 46.9
紫Purple 58.9 79.7
荚Pod color
绿Green 41.1 20.3
2478作物学报第48卷
表3豇豆F2、F3体数量性状的分布
Table 3 Distribution of quantitative traits in F2 and F3 populations of cowpea
F2F3
性状Trait 变异范围
Range of
variation
平均
Mean
value
变异系数
Variable
coefficient (%)
变异范围
Range of
variation
平均
Mean
value
变异系数
Variable
coefficient (%)
百粒重Hundred-grain weight (g) 11.3–31.320.0 21.56 11.4–28.5 19.7 19.61 荚长Pod length (cm) 11.6–55.232.4 25.83 14.4–51.3 27.6 23.97 主茎分枝数Number of branches per main stem 2–12 6.9 24.60 2–13 6.8 25.28 单株荚数Number of pods per plant 2–26 12.2 45.89 2–30 14.2 48.40 单荚粒数Number of seeds per pod 3–16 9.0 25.70 3–18 9.2 25.62 籽粒分布密度Seed density 0.13–0.900.40 34.40 0.14–0.80 0.35 35.93
卡方测验表明, 在F2体中, 紫花∶白花(P>0.05)、单∶双(P>0.05)及深系∶浅系(P>0.05), 均符合3∶1的分离比, 可视为质量性状。而数量性状的分布分析表明, 除百粒重(P<0.05)不符合正态分布
外, 荚长、主茎分枝数、单株荚数、单荚粒数及籽粒分布密度等数量性状均呈近似正态分布(P>0.05), 与F3家系的分析基本一致。
2.2测序数据分析
经质量过滤后, 母本总测序数为36,741,349, 共10.99 Gb, Q30为92.48%, GC含量为36.08%; 父本总测序数为38,135,995, 共11.41 Gb, Q30为93.45%, GC含量为36.04%。F2体共193个样本的测序数从2,543,678到10,385,456不等, 平均为6,886,565, 总数据量从760,452,928到3,109,124,322不等, 平均为2,061,194,017; GC含量从34.77%到38.88%, 平均为35.72%, Q30从90.38%到98.25%, 平均为93.22%。2.3SNP的开发及分布
经比对后, 亲本间共检测到1,070,323个SNP。其中732,127个SNP为转换, 占68.4%。338,196个为颠换, 占31.6%。母本纯合的SNP为941,285个, 占87.94%, 父本纯合的SNP为999,315个, 占93.37%。经筛选过滤后, 146,697个高质量SNP标记共划分为3061个Bin标记。
2.4连锁分析及图谱构建
根据上述3061个Bin标记的基因型及染体分布, 利用Highmap共将2984个Bin (142,146个SNP)定位到11个豇豆染体, 总遗传距离为1333.48 cM。各染体(Chr.)长度从84.63 cM (Chr.2)到183.15 cM (Ch
r.10)不等, 平均为121.23 cM。其中密度最大的为Chr.3 (0.27 cM), 最小的是Chr.4 (0.89 cM) (表4)。从标记数目来看, 染体大小与标记数呈显著正相关(r = 0.71), 如Chr.2最大(65.29 Mb), 标记数目也最
表4豇豆高密度图谱基本信息统计
Table 4 Basic information of a high density map for cowpea
染体Chromosome
SNP数量
Number of SNP
Bin标记数
Number of bin
阿明marker
总遗传距离
Total distance
(cM)
平均遗传距离
Average distance
(cM)
最大
Max. gap
(cM)
1 4689 184 93.68 0.51 3.53
2 9661 190 84.6
3 0.45 3.16
3 27,206 502 137.76 0.27 6.99
总裁与董事长
4 4231 146 129.47 0.89 5.41
5 10,175 280 130.4
6 0.4
7 4.05
2022年世界杯赛程6 14,72
7 193 103.91 0.54 7.36
7 9362 193 100.75 0.52 3.22
8 13,572 286 111.80 0.39 3.48
9 10,277 298 136.10 0.46 2.96
10 8552 293 183.15 0.63 10.73
11 29,694 419 121.57 0.29 2.33 总计Total 142,146 2984 1333.28 0.45 10.73
第10期
李建领等: 豇豆SNP 高密度遗传图谱构建及重要农艺性状QTL 定位 2479
多(502个bin); 然而染体大小与其遗传长度相关不显著(r = 0.4), 甚至与平均遗传距离呈一定的负相关(r = -0.3)。
2.5 农艺性状QTL 定位及候选基因筛选
在F 2、F 3体的QTL 定位中, 14个性状共检测到15个QTL 位点。F 2体中共检测到10个QTL, 其中荚质、主茎分枝数、籽粒分布密度和成熟期等4个性状均没有检测到QTL, 其余10个性状的QTL 位点分别分布在Chr.3、5、7、8、9、11。除荚长(Chr.3、5)、粒相关性状(Chr.5、7、9)分别检测到2个QTL 外, 其余性状均检测到单个QTL 。花和脐环有无同时定位在Chr.7的53.328~53.587 cM 之间, 而单荚粒数、百粒重、荚形也均在Chr.8的108.327~ 108.586 cM 间检测到QTL, 且定位区段重合。在F 3家系的数据分析中发现, 14个性状共检测到12个QTL, 分布在除Chr.2、4、6外的所有染体。除花和籽粒颜构成分别检测到2个QTL 外, 其余12个性状也均检测到单个QTL 。且花和脐环有无均在Chr.7的同一区段53.328~53.587 cM 检测到QTL, 而百粒重、荚形、单荚粒数和籽粒分布密度则均在Chr.8的同一区段108.327~108.586 cM 检测到QTL 。
综合F 2、F 3家系的QTL 定位结果发现, 百粒重、荚、花、籽粒颜构成、脐环有无、单荚粒数及单株荚数等7个性状在不同世代的定位结果一致, 荚长、粒在F 2代分别检测到2个QTL, 而在F 3家系仅检测到单个QTL, 相反, 花在F 3家系中检测到2个QTL, 在F 2体仅检测到单个QTL 。此外, 荚质、成熟期、籽粒分布密度、主茎分枝数等性状仅在F 3家系中检测到QTL 。
通过基因注释, 在上述QTL 区间内共发现52个非同义突变基因, 分别在11个区段内(附表1)。其中除荚质外, 其余性状相关QTL 区段内的均分别检测到1~17个不等的非同义突变基因。进一步分析发现, 在Chr.3的QTL 区段的非同义突变基因LOC114178564与有丝分裂有关的微管蛋白调控有关, 可能是荚长相关候选基因, 位于Chr.9的非同义突变基因 LOC114196343, 基因描述为蛋白透明种皮, 可能参与粒的调控, 而在Chr.8的非同义突变基因LOC114193834及LOC114193715分别与纤维素合成酶样蛋白有关, 可能与单株荚数的调控有关。
表5 豇豆农艺性状QTL 定位
Table 5 QTLs mapping of agronomic traits in cowpea
性状 Trait
位点 QTL 染体Chr.
起始位置 Start
终止位置End
加性效应 ADD
显性效应 DOM
贡献率 PVE (%)
荚质Pod type qPt1** 1 13.848 14.108 -0.107 0.148 21.753 qPL1 3 54.012 54.530 3.563 -1.498 14.666 荚长Pod length qPL2*
5 69.084 69.602 2.88
6 -0.486 7.032 主茎分枝数
Number of branches per stem qNuBS1** 5 37.989 37.989 -0.492 -0.206 1.488 qTSC1 9 62.767 63.285 -0.340
-0.336 9.650
籽粒颜构成 Type of seed color qTSC2 7 67.061 67.320 0.088 0.231 4.301 qFC1 7 53.328# 53.587 0.394 0.276 10.790 花 Flower color qFC2** 7 50.738 50.997 0.350 0.261 8.180 脐环有无
Presence or absence of hilum color qPAHC1 7 53.328# 53.587 -0.365
-0.313 7.342
qSC1** 7 52.551 52.810 2.877 2.532 13.780 qSC2* 5 19.178 19.437 0.621 -0.662 25.802 粒 Seed color
qSC3* 9 57.478 57.737 -0.375 -0.530 2.036 单株荚数Pods per plant qPP1 8 107.550 107.809 -1.728 -1.902 1.368 单荚粒数Seeds per pod qSP1 8 108.327##
108.586 -0.965 -1.579 4.818 荚形Pod shape
qPS1 8 108.327## 108.586 0.256 0.266 3.906 籽粒分布密度Seed density qSD1** 8 108.327## 108.586 0.816 0.752 5.011 百粒重Hundred-grain weight qSW1 8 108.327## 108.586 3.471 2.837
7.784
成熟期Mature period qMP1** 10 160.246 160.505 -2.375
-0.958 2.408
荚Pod color
qPC1
11 53.997 54.256 -0.602 0.409 48.682
*指仅在F 2检测到的QTL 位点, **
指仅在F 3检测到的QTL 位点, #、##指单位点对应多性状。
*
means QTLs detected based on phenotypic data for F 2; ** means QTLs detected based on phenotypic data for F 3; # and ## mean the same QTL
related with two or more traits.
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