苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第10期，第4614-4623页

评述与展望

R e v i e w a n d Progress

苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展

周燕朱英芝姜明国^

广西民族大学海洋与生物技术学院，广西多糖材料与改性重点实验室，南宁，530008

*通信作者,*****************

摘要苏云金芽孢杆菌作为生物杀虫剂己有近百年历史，其杀虫谱包括从鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目到线虫甚至是癌症细胞，对农林业生产以及医学领域研究具有非常重要的作用。全球每年死于蚊媒疾病的数目惊人。本综述首先介绍了首个被发现对双翅目幼虫具有杀蚊活性的苏云金芽孢杆菌以列亚种，详细叙述了该菌株的杀虫功能、菌株特点以及含有的多种杀虫毒蛋白基因；随后概述了报道的其他杀蚊菌株和杀蚊毒蛋白；还揭示了苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株Cry/C y t杀蚊毒蛋白的作用模式，为有关苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株的研究提供借鉴。

关键词苏云金芽孢杆菌，杀蚊菌株，fin'，毒蛋白，杀蚊作用模式

Advances Research on Bacillus thuringiensis Mosquitocidal Strains

Zhou Y a n Z h u Yingzhi Jiang Mingguo*

Guangxi Key Laboratory f or Polysaccharide Materials and Modifications, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University f or Nat i o n a l i t i e s,Nanning, 530008

* Corresponding author, *****************

DOI: 10.13417/j.gab.039.004614

A b stra ct Bacillus thuringiensis has been used as a biological insecticide nearly 100 years,and i t s insecticidal spectrum including Lepidoptera,Coleoptera,Hymenoptera,Diptera,Nematodes and even cancer cells.I t has a very important role in agricultural,forestry production and medical research.The number of death from mosquito-borne diseases every year in the world i s staggering.Here,w e firstly introduced Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,the f i r s t strain found insecticidal activity against Diptera larvae,and then described i t s insecticide function,strain characteristics as well as i t s insecticidal protein genes in detail.Subsequently, summarized other mosquito-killing strains and mos

quitocidal toxic proteins,finally,w e also comprehensively revealed the m o d e action of Cry/Cyt mosquitocidal toxins of Bacillus thuringiensis strains,which provided a reference for the investigation of Bacillus thuringiensis mosquitocidal strains.

K eyw ords Bacillus thuringiensis,Mosquitocidal strain,Bti,Toxic protein,M o d e action of mosquitocidal

蚊子是人类可怕疾病的重要传播媒介，世界卫生组织宣布蚊子为“头号公敌”(W H O, 1996, Report of W H O informal consultation on the evaluation and testing insecticides.C T D/W H O P E S/IC/96.)。蚊子种类繁多，目前大约有3 500多种。不同的蚊子种类能传播不同的疾病：疟疾(Malaria)主要是由h o p/ie/e s传播(L e h r e r,2010)、丝虫病(F i l a r i a s i s)是由 C W e h M o/i-s o/z i a和一些 4n o p/i e/e s s p p.传播、登革热（D e n g u e f e v e r)主要是如aegypn•、黄热病(Y e l l o w f e v e r)和寨卡病毒(Z i k a v i r u s)也主要是由/l e d e s引起的(M a l o n e et a l.，2016)。每年，死于蚊虫媒介疾病的报道数量惊人。2013年，黄热病导致约127 000例严

基金项目：本研究由广西科技基地和人才专项(桂科AD18281066)、广西科技重大专项(桂科AA18242026)和2018年度广西高校中青年教师基础能力提升项目2018KY0177共同资助

引用格式：Zhou Y.，Zhu Y.Z.，and Jiang M G.，2020, Advances research on fiac说us mosquitocid

al strains, Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology)，39( 10): 46M_4623 (周燕，朱英芝，姜明国，2〇2〇，苏z?金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展，基因组学与应用生物学，39(10): 4614-4623)

苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研宄进展 4615

重感染和45 000例死亡，其中近90%发生在非洲国家(W H O,2013, Yellow fever Fact sheetN 100)。2016 年，全球共有2.16亿疟疾病例，估计有445 000至 731 000例死亡，也是大约90%发生在非洲国家(W H O,2017, World malaria report2017)。因此，防蚊控蚊灭蚊行动刻不容缓。

目前，控制蚊子数量主要从物理、化学、生物以及环境等方面进行。由于物理和环境手段都只是防蚊，治标不治本，且效果不理想；化学防制虽然能快速有效杀灭蚊子，但给环境和人类身体带来危害，也不能长期使用。因此，对环境友好，不影响人体健康的生物防制越来越受到人们的青睐，成为了防蚊控蚊的重要措施。在众多的生物杀蚊剂中，苏云金芽孢杆菌制剂以高效特异的杀蚊活性，被广泛使用。

苏金牙抱杆菌(B o c i Z Z i w t/i u r i n g i e/w i s,B t)是革兰氏阳性芽孢形成细菌，能产生具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白 8_e n d o t o x i n s(B r a v o e t a l.，2005)。8-e nd o t o x i n s主要包括 C r y和 C y t类毒蛋白。研究发现，C i y蛋白对不同目昆虫具有特异杀虫活性，如鳞翅目 (L e p i d o p t e r a)

、

鞘翅目（C o l e o p t e r a)、膜翅目（H y m e n o p-t e r a)、

双翅目（D i p t e r a)或线虫(N e m a t o d e s)等；而 C y t 蛋白只对双翅目昆虫有活性(B r a v o e t a l.，2005)。由于 B t对环境和非靶标物种安全友好，作为生物杀虫剂被广泛用于世界各地控制农林害虫以及防蚊控蚊

(B e c k e r,2000; B r a v o e t a l.,2005)。

1 及其特异双翅目毒蛋白

苏z?金牙抱杆菌以列亚种(_6〇<：说1«认1^?1^1>«- ■s i s subsp.israeZerm's (B h))是首个被发现对双翅目幼虫具有杀蚊活性的苏云金芽孢杆菌亚种。目前，份i 制剂是美国和其他国家的主要幼虫灭蚊产品之一(Lacey,2007)；在蚊子幼虫摄取制剂后，在肠道高碱性p H环境下活化制剂，释放出蛋白质毒素，导致幼虫中肠的上皮细胞裂解，杀死幼虫。份^比任何之前已知的生物杀虫剂能更有效地控制许多蚊子和黑蝇幼虫，并且在田间广泛使用长达35年的时间里，并未有抗性产生的报道(Becker and Ludwig, 1993; Loke et al.,2010; K a m g a n g et al.,2011; Tetraeu et al.,2013)〇虽然近些年有报道称一些野外种出现易感性降低，但是种和不同实验室菌株的自然变异以及生物测定实验中的固

有技术差异，也是解释生物测定结果时需要考虑的问题(Paul et al.，2005; Boyer et al., 2012)。缺乏对S h产生抗性主要归因于不同的作用模式以及4个主效毒蛋白(Cry4A a,Cry4B a,Ciyl lAa 和CytlAa)之间的协同增效作用(Crickmoreetal.，1995; Wirth et al”2005)。

B n'原始分离株有8个大小范围在5〜210k b的圆形质粒和一个约为16k b的

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a l.，1989;V i s i c k e t a l.，1991;X u e t a l.，2001)。C r y和C y t蛋白都是膜孔形成蛋白，

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长期使用同一类型的杀虫剂，田间昆虫易产生抗性，这是苏云金芽孢杆菌作为杀虫剂需要面对的一个瓶颈，为解决这些问题，研宄人员不断挖掘新型 B t菌株以及新型毒蛋白基因。而杀蚊菌株份i在田间使用至今长达40年的时间里，大数据搜索并未显示有抗性现象产生，这与S«i8-Endotoxins (Cry4A a, Cry4B a，C r y l O A a,C r y l l A a,C y tlAa 和 Cyt2B a)之间的协同增效作用有关。虽然4个C r y蛋白的毒性比 C y t蛋白毒性高，但是他们之间的强烈的协同作用产生了更高的活性(Crickmore et al.，1995; Wirth et al.，2005; Otieno-Ayayo et al.，2008)。

2其他B t杀蚊菌株

1977年第一个对双翅目媒介昆虫有毒杀活性的办Z?金牙抱杆菌以列亚种（

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s u b s p.份i)菌株问世了（G o l d b e r g a n d M a r-

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S h是目前应用于生物控蚊最成功有效的例子，已有近40年的历史了，但仍未有报道关于蚊子在自然条件对其产生抗性(Bravo and Soberon,2008)。这归因于如体内多种毒素间相互作用，尤其是C y t毒素对C r y毒素的协同增效作用，可大大提高C r y的毒力，同时蚊子盲肠和后中肠含有多种受体，能满足不同毒素可能对应不同的受体的情况，不会因为某一

4616基因组学与应用生物学

受体缺失导致抗性的产生，从而延缓蚊子对其产生抗性(Bravo et al.，2005)。总之，份对蚊子及其他双翅目昆虫幼虫具有高毒力，而对其它非靶标生物无影响或影响较小；并且能在自然环境中降解，对环境无污染，长期使用也不易产生抗性，是目前应用最广泛有效的微生物杀蚊剂。

然而，即使是高效的扮i杀蚊剂，也只是对某几种类型的蚊子和某些双翅目昆虫具有杀蚊活性，而对其他类型的蚊子以及双翅目害虫的杀虫活性很低或者基本没有活性，这就需要不断开发新型B t菌株，以弥补那些产生抗性菌株的空缺，从而能更好地实现生物防治农业害虫的目的。为此，世界各国都在挖掘本土 B t菌株资源，据报道，中国、巴西、阿根廷、加拿大、日本等国家己经从各种不同生境样品中筛选分离鉴定到了许多具有特异杀蚊活性的B t菌株，且多数属于不同的鞭毛血清型和B t亚种(表1)，当然，也有些杀蚊菌株无法鉴定到己知的鞭毛血清型或者未进行鞭毛血清型鉴定。本综述中仅列出了报道的己知血清型的杀蚊菌株，至于那些未鉴定到血清型或者虽然鉴定有血清型但尚未明确靶标昆虫的菌株，未公开报道的目前都无法进行数据统计。从研究结果可以看出，大部分的菌株来自于土壤分离物，但植物表面，动物排泄物也是主要分离源。

3 B t杀蚊毒蛋白

研宄表明，虽然C r y毒蛋白只对靶标昆虫特异具有毒性，但是不同的C r y毒蛋白能对不同目昆虫具

有特异毒性，包括从鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、以及线虫，甚至癌症细胞等，而目前报道显示，C y t毒蛋白只对双翅目昆虫具有活性(Bravo et al_,2005)。目前，在B t毒蛋白命名系统中有命名且在G e n B a n k上描述对双翅目昆虫有毒杀活性的蛋白不多，而明确具体双翅目靶标昆虫的杀蚊毒蛋白并有文献报道的则更少，经整理统计大概有52个毒蛋白(表2)。从表中可以看出，大部分报道的测试靶标为埃及伊蚊C4d m 、黄尾拒蚊〇4 n.o/)/i.e Z e s step/ie/wt’）和致倦库蚊

(CuZex换目之，这些毒蛋白对其他双翅目靶标昆虫是否有活性，还有待进一步研究测试；另外，在这51个毒蛋白中，分别属于33类一级毒蛋白，这说明杀蚊毒蛋白类型丰富。

另外,B t毒蛋白之间的协同增效作用，能提高组合的生物活性，并能延缓害虫抗性的产生，因为同时对两种毒素都失去敏感性需要多种突变的发生(Zhao et al.，2005)。比如中，Cytl A a与 Cryl1A a之间协同增效作用，C y t l A a能作为C r y l l A a结合昆虫B B-M V的一个受体，而使其组合成孔能力增强，膜渗透压迅速失去平衡导致昆虫快速死亡(P6rezetal.,2007)。除此之外，Z w A、辅助蛋白、几丁质酶及激活蛋白等一些辅助因子也能与B t毒蛋白之间起协同增效作用，如几丁质酶对B t毒蛋白具有协同增效作用，其增效机理是由于大部分昆虫中肠围食膜的主要成分是几丁质，而围食膜是昆虫抵御细菌和病毒侵染的一道天然屏障。单独的几丁质酶，杀虫毒性不高，但与B t毒蛋白共同作用后，可能有助于B t侵染昆虫幼虫从而加速幼虫患病进程，提高幼虫死亡率(办- kharyan et al_，1976)。共表达几丁质酶和B t毒蛋白的研究发现，几丁质酶能有效增强C i y l A c对棉铃虫 (//efcowrpa armigera)

(Ding et al.,2008)和CrylC 对斜纹夜蛾(S/)Zo/)tera toora/is)的活性(Regev et al.，1996)。通过I C P s和几丁质酶的协同作用有利于克服或延缓昆虫的抗性的产生。

4 Cry/C y t毒蛋白的杀蚊作用模式

通常，Cry/C y t毒蛋白都是以原毒素的形式产生，在敏感昆虫中肠中溶解，被中肠蛋白水解酶水解形成有活性的毒性核心区(Braove et al.,2005)，随后活性毒性蛋白与中肠上皮细胞受体相结合形成孔道，细胞裂解，导致细胞渗透压失衡，最终导致昆虫死亡(de M a a g d et a丨.，2001; Bravo et al.，2005)。

C r y毒素是特异性结合到中肠上皮细胞受体，在鱗翅目昆虫幼虫中，己报道的C r y毒素特异受体主要有4个：糖基磷脂酰肌醇锚定氨肽酶N(GPI-A P N)，糖基磷脂酰肌醇锚定碱性磷酸酶(G P1-A L P)，钙粘着蛋白(cadherin-like protein,C A

D R)和 270 k D 糖缀合物(Glycoconjugate)(Knight et al.，1994; Vadlamudi et al., 1995; Valaitis etal.,2001; Jurat-Fuentes and A d a n g, 2004)。相反,C y t毒素是不结合到受体上的，而是直接与膜脂作用插入到膜中形成孔道(Promdonkoy and Ellar，2003)或者像洗涤剂作用一样直接破坏细胞膜 (Butko etal., 1997)〇

埃及伊蚊C4 oegypfi)幼虫刷状缘H吴囊(brush border m e m b r a n e vesicles,B B M V)上 65 k D 的结合蛋白是双翅目特异性毒素Ciyl1A a和Cry4B a的受体，随后被鉴定为G P1-A L P受体蛋白(Buzdinetal.,2002)。另外，一个200 k D的跨膜蛋白也被鉴定为CryllAa 的结合蛋白，这表明蚊子体内也存在多个C r y毒素受体且发现这些G P I-A L P受体定位于盲肠和后中肠 (F e m6ndez et al.，2006)。而 CryllAa 毒素 G P I-A L P

苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展4617

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苏云金芽孢杆菌杀蚊菌株研究进展

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