·论 著·
临床意义
邹 珏，范钦和，蔡 勇，宋国新
(南京医科大学第一附属医院病理科，南京 210029)
张铁林资料[摘要] 目的 研究高分化及去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中M DM2基因和蛋白表达的可行性及临床意义。方法 收集17例高分化及去分化脂肪肉瘤，对照组肿瘤标本18倒，均为甲醛固定石蜡包埋组织,M DM2基因检测用反转录聚合酶链反应(RT2PCR)法，以看家基因β2actin为内参照。蛋白检测用免疫组化EnVision二步法。结果 用RT2PCR法检测的10例高分化及去分化脂肪肉瘤均有M DM2基因表达，而对照组肿瘤标本只检测到β2actin基因，未检测到M DM2基因。17例高分化及去分化脂肪肉瘤M DM2蛋白表达率显著高于18例对照组肿瘤标本(P<0105)。
结论 在高分化和去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中,RT2PCR法检测M DM2基因和免疫组化法检测M DM2蛋白可行，且两者结果对其诊断和鉴别诊断有意义。
[关键词] 脂肪肉瘤; M DM2; 反转录聚合酶链反应; 免疫组化; 鉴别诊断
[中图分类号] R73816 [文献标识码] A [文章编号]1007-8096(2007)03-0168-04
Detection of MDM2gene and protein in w ell2differentiated and dedifferentiated liposarcom a and its clinical significance
ZH OU Jue,FAN Qin2he,C AI Y onɡ,et al.
(Department of Pathology,the First A ffiliated H ospital,NɑnjinɡMedical University,Nɑnjinɡ210029,China)
Abstract: Objective T o assess the feasibility and significance of detecting M DM2gene and protein in paraffin2embedded tissues of well2differentiated liposarcoma(W D LPS)and dedifferentiated liposarcoma(DD LPS). Methods Seventeen formalin2 fixed and paraffin2embedded(FFPE)samples of W D LPSΠDD LPS were retrieved from archives and consultation materials,together with eighteen cases of controlled tum or.M DM2gene were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT2PCR) and home2keeping geneβ2actin was used to detect the quality of mRNA.The proteins were detected by immunohischemistry of EnVision method. R esults T en W D LPSΠDD LPS samples were detected by RT2PCR and M DM2gene expression was detected in all the tum ors,as comparied withβ2actin mRNA.The positive rate of M D
嚣怎么读M2protein expressed in seventeen W D LPSΠDD LPS was significantly higher than that of eighteen controlled tum ors(P<0105). Conclusions RT2PCR for the detection of M DM2gene and immunohistochemistry for M DM2protein are feasible methods in FFPE tissues of W D LPSΠDD LPS.The results are meaning ful in diagnosis and differential diagnosis of the tum ors.
K ey w ords:Liposarcoma;M DM2;RT2PCR;Immunohistochemistry;Differential diagnosis
脂肪肉瘤根据其分子学特点可分为三大类：高分化脂肪肉瘤(well2differentiated liposarcoma, W D LPS)Π去分化脂肪肉瘤(dedifferentiated liposarcoma,DD LPS)、黏液Π圆细胞脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤。在组织学上,W D LPS由较成熟的脂肪组织构成，但细胞常大小不一，伴散在的深染异型核及脂母细胞(图3)；而DD LPS是一种含分化好的脂肪肉瘤样区及突然出现恶性的非脂肪源性的肉瘤样区两种成分的恶性脂肪源性肿瘤，肉瘤样区可向恶性纤维组织细胞瘤或纤维肉瘤样分化(图4)。大约有10%的W D LPS可能进展为DD LPS，有人认为W D LPS 进展为DD LPS是随着时间的延展而发展的，而且在细胞和分子遗传学特点上,W D LPS/DD LPS都有特征性环状和/或巨大标记染体；研究显示，这些特征染体由12q13215扩增而来，且这一区域最恒定的扩增是M DM2(human hom ologue of the murine double2 minute type2)基因[1-4]。镜下观察W D LPS与良性脂肪性肿瘤很相似,DD LPS去分化区域常常与恶性纤
维组织细胞瘤、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤鉴别困难。另外两型脂肪肉瘤分子学特点与W D LPS/DD LPS不同，少有12q13215扩增[4,5]。我们对17例W D LPS/ DD LPS甲醛固定石蜡包埋组织用RT2PCR和免疫组化法检测M DM2基因和蛋白的表达，探讨其在W D LPS/DD LPS诊断和鉴别诊断中的价值。
1 材料与方法
111 材料 收集南京医科大学第一附属医院和镇江第一人民医院病理科1997—2005年间10例W D LPS和7例DD LPS，其中DD LPS选择其去分化成分，均为甲醛固定石蜡包埋组织，另外收集对照标本18例，其中梭形细胞脂肪瘤、血管脂肪瘤、脂肪瘤、脂母细胞瘤、黏液脂肪肉瘤、多形性脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤各2例。常规染，形态学观察，参考免疫组化表型，确定诊断。
112 RNA抽提 参照文献[6]略作改动。用专一刀片切取5μm厚切片20～30片，置于115ml已消毒的离心管中。加入二甲苯1ml脱蜡,37℃,10min，离心去上清，重复1次。然后用1ml纯乙醇洗2次，离心后去上清，干燥。加裂解液(20mm ol/L T ris HCl,pH810;20mm ol/LE DT A,1%S DS)200μl，加蛋白酶K至终浓度1mg/ml,55℃过夜，直至组织完全裂解;95℃,10min灭活蛋白酶K。RNA抽提采用Invitrogen公司的TR I zol试剂。以下提取为常规RNA提取，甲醛变性胶检测RNA质量,-70℃冻存。
113 RT2PCR 反转录采用Promega公司反转录试剂盒，按操作说明进行。扩增cDNA和PCR反应总
体积分别为20μl 和25μl，扩增引物β2actin上游引物(5′2 AG CG C AAG T ACT CCG TG TG23′)，下游引物为(5′2 AAG C AATG CT AT C ACCT CCC23′)，长度501bp;M DM2基因上游引物(5′2G CT C AT CC AC ACC AACT CC23′)，下游引物(5′2 TGG TGG C AG ATG ACTG T AGG23′)，长度241bp。所用引物均由上海生物工程技术有限公司合成。循环扩增条件为:95℃预变性5min，然后94℃变性50s,59℃退火30s,72℃延伸59s，共31个循环，终末延伸72℃7min,4℃1min。以双蒸水代替模板作为阴性对照。以看家基因β2actin作为内参照，反映石蜡组织中RNA保存情况和反转录效果。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙啶染后，紫外灯下观察。
114 免疫组化 采用EnVision二步法，一抗为单克隆鼠抗人M DM2抗体(福州迈新生物技术开发有限公司)，石蜡切片5μm厚，常规二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水，柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复,P BS冲洗，滴加M DM2单抗置湿盒4℃冰箱过夜, P BS冲洗，滴加EnVision system,HRP二抗37℃，孵育30min, P BS冲洗,DAB显5～10min，苏木精复染，脱水透明封片。一抗以P BS代替作为阴性对照。
115 结果判定 先按染强度评分：无为0分，浅黄为1分，棕黄为2分，棕褐为3分。再按阳性细胞所占百分比评分:(-)为0分，阳性细胞≤10%为1分,11%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分，染强度与阳性细胞数乘积≥2分为(+)。
2 结果
211 临床病理资料 10例W D LPS中，男性7例，女性3例，年龄21～56岁，平均4311岁；肿瘤发生在腹膜后及腹腔6例，纵隔1例，臀部1例，四肢2例。7例DD LPS中男性5例，女性2例，年龄30～74岁，平均5811岁，肿瘤发生在四肢3例，腹膜后3例，精索1例。W D LPS5例复发,1例进展为DD LPS;DD LPS5例复发,2例死亡。
212 分子生物学及免疫组化 分子生物学方法检测的10例W D LPS(6例)/DD LPS(4例)中β2actin mRNA检测结果为阳性(图1)，且均检测到M DM2基因(图2),9例对照组肿瘤中只检测到β2actin mRNA 未检测到M DM2基因。W D LPS/DD LPS中M DM2蛋白在肿瘤细胞核明显表达阳性(图5,6),17例中阳性13例，阴性4例W D LPS和DD LPS各2例;18例对照组肿瘤标本中1例恶性纤维组织细胞瘤阳性，余17
例阴性，用确切概率法分析有统计学意义(P< 0105)。
3 讨论
W D LPS/DD LPS是脂肪肉瘤中很常见的类型，全身各部位软组织均可发生，但常见于四肢和腹膜后。W D LPS低度恶性，易复发、不转移可进展为DD LPS; DD LPS最常发生在腹膜后，恶性度较高。两者在组织学和免疫表型上特征不明显,DD LPS有高度恶性肉瘤(如恶性纤维组织细胞瘤)的区域，即去分化。
因此W D LPS与良性脂肪性肿瘤以及DD LPS与恶性梭形/多形未分化肿瘤的鉴别仍是一个难题。
目前，对W D LPS/DD LPS环状和/或巨大标记染体的研究发现都有12q13215区域的扩增，该区域包括多种导致肿瘤发生的基因如M DM2、C DK4和S AS等，其中最恒定的扩增子是M DM2基因，它除可致肿瘤发生外还可作用于p53基因而使肿瘤发生[7-10]。C oindre等[8,9]用CGH、FISH法检测到具有M DM2和C DK4基因的恶性纤维组织细胞瘤其实是DD LPS。资料显示,M DM2基因在W D LPS/DD LPS中的敏感性和特异性分别是97%和83%[11]。目前已有很多学者用RT2PCR法在石蜡包埋组织中检测融合基因帮助鉴别诊断取得成功。在石蜡包埋组织中提取RNA时内源性RNA酶对它有很大的影响，如果标本能及时、完全的固定会减少这方面的影响[6]。本实验从标本保存时间和石蜡组织中肿瘤成分多少等方面考虑，选择了10例W D LPS/DD LPS用RT2PCR 法检测，均检测到M DM2基因;9例对照组肿瘤只检测到β2actin mRNA，两者差异显著。虽然国际上M DM2基因检出率>90%，本实验检出率相
对偏高，但仍可说明RT2PCR法在W D LPSΠDD LPS石蜡包埋组织中检测M DM2基因可行并具鉴别诊断意义。在黏液和多形性脂肪肉瘤中未检测到该基因进一步说明它们在分子生物学特点上属于不同的类型。W D LPS和DD LPS恶性程度不同，但两者之间M DM2量的表达差异是否会导致W D LPS向DD LPS发展还有待进一步研究。有学者研究发现,DD LPS中M DM2量高于W D LPs，但具体机制还不清楚[7]。Binh等[11]通过对559例软组织肿瘤用免疫组化法分析发现，在一些恶性软组织肉瘤中M DM2蛋白可表达阳性，但在良性脂肪性肿瘤中很少表达。本实验中M DM2表达阳性率在W D LPS/DD LPS与对照组肿瘤标本对比差异显著，但在有些蛋白表达阴性的W D LPS/DD LPS中M DM2基因检测却是阳性，可见M DM2基因检测比蛋白检测可靠。对于未用RT2 PCR法检测的标本，分析可能原因是多方面的，石蜡组织保存时间越久提取RNA的效果越不理想，组织中肿瘤成分的多少以及标本处理等也影响结果。这说明RT2PCR法检测对标本的要求比免疫组化要高，敏感性也高。部分W D LPS/DD LPS中M DM2表达阴性，分析原因可能有些确实是真阴性，因为只有97%以上的W D LPS/DD LPS表达M DM2，有些阴性则可能是由于技术或标本质量原因造成的。
参考文献:
[1] M icci F,T eixeira MR,Bjerkehagen B,et al.Characterization of
lol闪退修复supernumerary rings and giant marker chrom os omes in well2
differentiated lipomatous tum ors by a combination of G2banding,
CG H,M2FISH,and chrom os ome2and locus2specific FISH[J].
Cytogenet G enome Res,2002,97(122):13-19.
[2] M eis2K indblom JM,S jogren H,K indblom LG,et al.Cytogenetic and
m olecular genetic analyses of liposarcoma and its s oft tissue
simulators:recognition of new variants and differential diagnosis[J].
Virchows Arch,2001,439(2):141-151.
[3] Pilotti S,Della T orre G,M ezzelani A,et al.The expression of
M DM2ΠCDK4gene product in the differential diagnosis of well
differentiated liposarcoma and large deep2seated lipoma[J].Br J
Cancer,2000,82(7):1271-1275.
家用净水器安装
[4] Fritz B,Schubert F,Wrobel G,et al.M icroarray2based copy
number and expression profiling in dedifferentiated and pleom orphic
liposarcomal[J].Cancer Res,2002,62(11):2993-2998.
[5] Antonescu CR,E lahi A,Healey J H,et al.M onoclonality of
multifocal myx oid liposarcoma:con firmation by analysis of T LS2CH OP
or EWS 2CH OP rearrangements [J ].Clin Cancer Res ,2000,6(7):2788-2793.
[6] 贡其星，范钦和，张智宏，等.RT 2PCR 法检测外周原始神经外
胚叶瘤石蜡包埋组织中EWS 2F LI1融合基因[J ].临床与实验病理学杂志,2005,21:151-154.
[7] H ostein I ,Pelmus M ,Aurias A ,et al .Evaluation of M DM2and
CDK 4am plification by real 2time PCR on paraffin wax 2embedded material:a potential tool for the diagnosis of atypical lipomatous tum ours Πwell 2differentiated liposarcomas[J ].J Pathol ,2004,202(1):95-102.
[8] T amborini E ,Della T orre G,Lavarino C ,et al .Analysis of the
m olecular species generated by M DM2gene am plification in liposarcomas[J ].Int J Cancer ,2001,92(6):790-796.
[9] C oindre JM ,H ostein I ,M aire G,et al .In flammatory malignant
fibrous histiocytomas and dedifferentiated liposarcomas :histological review ,genomic profile ,and M DM2and CDK 4status fav our a single entity[J ].J Pathol ,2004,203(3):822-830.
[10] C oindre JM ,M ariani O ,Chibon F ,et al .M ost malignant fibrous
histiocytomas developed in the retroperitoneum are dedifferentiated liposarcomas :a review of 25cases initially diagnosed as malignant fibrous histiocytoma[J ].M od Pathol ,2003,16(3):256-262.[11] Binh M B ,Sastre 2G arau X ,G uillou L ,et al .M DM2and CDK 4
siri搞笑对话Immunostainings are useful adjuncts in diagnosing well 2differentiated and dedifferentiated liposarcoma subtypes [J ].Am J Surg Pathol ,2005,29(10):1340-1347.
哪个网页游戏好玩收稿日期:2006-10-21
脾血管肉瘤1例
王晓红1
，郝亚新1
，陈 杰2
(11平谷区医院病理科，北京 101200;21北京协和医院病理科，北京 100730)[关键词] 脾; 血管肉瘤; 诊断
[中图分类号] R7301262 [文献标识码] B [文章编号]1007-8096(2007)03-0171-01
患者男性,78岁。左上腹胀痛1月余。查体：左下腹压痛，肝脾肋下未触及。实验室检查：血常规、血生化、肝肾功能均正常。B 超、CT 示脾占位。行脾切除术。术中见大网膜与腹膜广泛粘连，脾与膈肌粘连，脾表面布满突起的结节；肝无明显异常，无血性腹水。
病理检查 巨检：脾一个，大小14cm ×9cm ×7cm ，质硬，切面呈暗紫红，见多数紫红结节，直径012～014cm ，均匀一致，弥漫分布。镜检：脾组织结构破坏，由不规则裂隙样管腔或相互吻合的小血管构成(图1)，衬覆异型增生的窦内皮，单层或复层，并向窦腔内呈小丘状或乳头状突起，部分游离于窦腔内。瘤细胞呈梭形、多角形，核肥大，浓染，核分裂易见(图2)。免疫组化:C D31、C D34和S M A (+),C D8、
C D68(-)
。
病理诊断：脾血管肉瘤。
术后8个月死于多脏器转移。
讨论 脾血管肉瘤为罕见的高度恶性肿瘤。原发性脾恶性肿瘤占全身恶性肿瘤不足1%，脾血管肉瘤约占脾恶性肿瘤7%，是来自血管内皮的恶性肿瘤。多发生于老年人，男性居多，偶见于幼儿及青少年，多认为与放疗、化疗及接触过氧化物、二氧化钍和砷有关。临床主要表现为左上腹痛、
发热、巨脾、消瘦和贫血,1Π3患者发生脾破裂和血性腹水[1]
。
病理大体可见肿瘤在脾实质内形成多数紫红结节，常伴有出血、坏死及囊性变。光镜下肿瘤细胞呈梭形或多角形，有显著间变，核分裂多见。形成裂隙样腔隙或由互相吻合的小血管构成。在血管的腔内见有成堆的内皮细胞呈乳头样增生，内皮细胞体积肥大，向管腔内突出呈钉突状。免疫组化:
C D31和C D34(+)。
脾血管肉瘤的主要方法是脾切除联合化疗或放疗。本瘤恶性程度高，瘤组织生长迅速，侵袭力强,80%左右患者都在短期内发生广泛转移，肝转移率达70%，其次为骨髓、淋巴结和脑等。手术根治性切除率低，由于病情发展快，转移早，预后较差。如果肿瘤未破裂出血、未发生转移，切除脾可存活较长时间；如已发生转移或出现系统性血管内皮肉瘤，则在短时期内死亡。早期发现、早期是原发性脾血管肉瘤患者长期生存的希望。
收稿日期:2006-09-20
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