•1218 •中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2018 Sep；34(9) ：1218 ~25
网络出版时间：2018/8/2& 11 :5& 网络出版地址：h tt p://kn. c nk i. n e t/k c m./d e t a il/&4. 1086. R.20180822. 1149. 016. h t m l
(延边大学1.肿瘤研究中心、2.医学院病理学教研室，吉林延边133002;
3.金泽大学医学部病理学教研室，日本金泽9208640)
doi:10. 3969// issn. 1001 - 1978. 2018.09.008
文献标志码:A 文章编号:1001 -1978(2018)09 -1218 -08中国图书分类号：R-332;R322.47;R329. 24;R329. 25;R575. 7 摘要：目的探讨m T0R C1/2抑制剂P P242诱导多囊肾(polycystic kidney，PCK)大鼠胆管上皮细胞凋亡和自噬、抑制细胞增殖及胆管囊性扩张的分子机制。方法免疫组织 化学染法检测PC K大鼠胆管上皮细胞中p-m T0R和p-Akt 的表达;W ST-1比法检测'帕霉素和PP242对胆管上皮细 胞增殖活性的抑制作用，以及LC3、Beclm-1基因沉默和自噬 特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-m e/yladenine，3-MA)对细胞 增殖的影响；蛋白免疫印迹法检测P P242对P I3K/A kt信号 通路相关蛋白、
自噬标识蛋白L C3和Beclin-1、cleaved c a p a/G表达的影响；流式细胞术和ELISA法检测PP242 对细胞凋亡的影响；免疫荧光染法检测L C3在细胞质中 的表达情况;3D细胞培养检测R i/■基因沉默和'帕霉素 联用及'帕霉素单独应用时对大鼠胆管上皮细胞成球能力 的影响。结果p-m T0R和p-A k t在P C K大鼠胆管上皮细
收稿日期:2〇18 -05-15，修回日期:2018 -06-10
作者简介：闫文帝（1991 -)，女，硕士生，研究方向：肿瘤分子病理 学，E-mail :304783592@qq. com;
任香善（1976 -)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方
向：肿瘤分子病理学，通讯作者，E-m ail: renxsh@ybu. edu. c
estab lish ed Q y M P P+injury i S H-SY5Y c e lls.T he cytotoxicity of M P P+w as d etec ted by MTT a ssay.T he e f e c ts of SalD on viability of S H-SY5Y cells w ere exam ined by MTT an d LDH a s a y.T he apoptosis of S H-SY5Y cells w as d etec ted by A0//E B a s a y.T he levels of R0S an d m itochondrial superoxide w ere determ in ed u sin g D C FH-D A an d M itoS0X p ro b e s，resp e ctiv ely. M itochondrial function w as exam ined by m easuring A TP level an d m itochondrial m em brane
p o te n tia l.T he levels of P G C-1a an d its dow nstream regulatory genes N R F1an d TFAM m R N A w ere d etec ted by q P C R.T he protein levels of P G C-1a，N R F1an d TFAM in cells w ere d etec ted by W estern blot an d im m unofluorescence a s sa y s.Results M P P+injury resu lted in a significant red u ctio n of cell viability to51. 34%. 0. 1，1，5 .m o l 胞中呈过表达，PP242比'帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖效 果更为明显，且呈浓度和时间依赖性改变（P<0. 05);PP242 明显抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;PP242可诱 导细胞凋亡和自職，上调cleaved ca/a/-3、Beclm-1和LC3- II/LC3-I比值。Rictoi■基因沉默和'帕霉素联用比'帕霉素 单独应用对大鼠胆管上皮细胞的抑制作用更为明显;LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA均可明显减弱PP242对细胞增殖 的抑制作用（P <0.05)。结论 PP242可通过PI3K/A k t mT0R信号通路抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的增殖，其机制 与细胞凋亡和自噬密切相关。
关键词：自噬；凋亡；P I3 K/Akt/mT0R信号通路；多囊肾大 鼠;PP242; C a rli n
C a r l i病是一种常染体隐性遗传性多囊肾疾病（autosom al recessive polycystic kid n ey d is e a s e，
A R P K D)的肝胆管病变，主要表现为肝内胆管的扩 张，常合并门脉高压及胆道炎症[1]。目前，其 手段主要为对症或肝移植，尚无有效的方 案[2]。多囊肾（polycystic k id n e y，P C K)大
鼠为 Caroli 病和A R P K D的常用动物模型，是目前为止唯一能 够充分反映多发性胆管囊肿和肝纤维化的动物模
•L-1 SalD and 5 mmol•L-1NAC0ould redu0e M PPg-induced SH-SY5Y cell in j ury and LDH release. The cell viability increased to67.98%，71.79%，76.91%and 77. 55%，respectively.Moreover，SalD could reduce the increase of intracellular R0S and mitochondrial superoxide induced by M PP+，decrease mitochondrial membrane potential and improve mitochondrial function.SalD also significantly increased both the transcription and expression levels of PGC-1a，NRF1and TFAM.Conclusion SalD could inhibit M PPg-induced SH-SY5Y cell in j ury and improve mitochondrial function and mitochondrial biosynthesis. K e y w o rd s：salvianolic acid D；M PPg；SH-SY5Y；mitochondria6function; mitochondria6biosynthesis; PGC-1a
周杰伦女友昆凌照片中国药理学通报2018 Sep;(4(9)•1219 •
型）
PI3K/A kt/m TO R是可以调节细胞增殖、凋亡和 自噬的信号通路。研究表明，在乳腺癌、胃癌、肺癌 等多种癌症中异常活化[3;4]。雷帕霉素是经典的 m TO R抑制剂，是m T O R C l的变构抑制剂，对多种肿 瘤有抑制作用[5]。PP242可同时抑制m T O R C l和mTORC2，减少负反馈导致的耐药问题[8]。
研究证 实，PD K/Akt/mTOR信号通路中 p-Akt、p-mTOR、p-S6等蛋白在A R P K D中呈高表达[7]，提示Ak/ m TO R信号通路与A R P K D的发生、发展密切相关。目前为止，尚无PP242对C aro li病的研究报道。本 研究旨在阐明m T O R的双重抑制剂PP242对PCK 大鼠胆管上皮细胞增殖、凋亡和自噬的影响，进一步 探究其机制，为C aro li病的临床提供新的实验 基础和理论依据。
1材料
!1细胞及组织标本正常和P C K大鼠胆管上皮细胞以及肝组织蜡块标本均由日本金泽大学病理学 教研室提供。
!2试剂雷帕霉素、PP242购自美国Sigma-Aldrich公司;3-甲基腺_吟(3-methyladenine，3-M A)购自Calbiochem公司，用D M SO配制浓缩液，分装保存于-20°C冰箱；Alexa-488荧光二抗及p-mTOR、p-Akt、Akt、p-4EBP1、4EBP1、LC3、Rictor、Beclin-1抗 体，均购自美国Cell Signaling Technology公司；#-ac-tin抗体购自美国Ab e a m公司；ss D N A E L IS A凋亡试 剂盒购自M illipore公司。
!3仪器激光共聚焦显微镜（德国L e ica公司）；倒置相差显微镜（日本Olym pus公司）；流式细胞仪 (日本 Bay Bioscience公司）；EnVision+ system(丹麦 DakoCytomation公司）；全波长多功能酶标仪（瑞士 Tecan)。
2方法
2.1 P C K模型的制备与分组P C K大鼠是C rj:
C D(SD)大鼠的PKHD1基因自发突变而来的动物 模型，由日本查尔斯河实验室的Katsuyama等[8]首 次报道。2001年，日本金泽大学人体病理学实验室 Sanzen等首次提出P C K大鼠可作为ARPICD，特别 是伴有先天性肝纤维化（congenital hepatic fibrosis，CH F)的C aro li病的实验动物模型。本实验中使用 的正常S D大鼠和P C K大鼠，均购自于日本查尔斯 河实验室，动物实验的指导原则均按照日本金泽大 学实验动物指南进行。
2.2大鼠胆管上皮细胞的分离与肝组织标本的制备胆管上皮细胞的分离方法如Sato等所述[9]，取8周龄的正常S D大鼠和P C K大鼠，用不含钙和镁 的平衡盐溶液冲洗门静脉，再向门静脉内灌注含有 0. 04b胶原酶和0. 22b分散酶的DMEM/F-12培养 液静置20 min，待正常和P C K大鼠胆管上皮细胞分 离后，置于含10b胎牛血清、5 .m o•L—1毛喉素、20 .mol•L_1表皮生长因子和1b青-链霉素的 DMEM/F-12培养液，于37°C、5b C O2细胞培养箱 中常规培养。取10月龄正常和P C K大鼠的肝组 织，4b甲醛缓冲液(pH 7. 4)浸泡固定，石蜡包埋处 理，将蜡块切成4 .m厚切片，备免疫组化染用。2/免疫组织化学染采用E n V i i n法，大鼠 组织切片常规脱蜡及水化，梯度乙醇入水，抗原修复 用10 nmoL•L—1枸橼酸盐柠檬酸钠缓冲液（pH 6. 0)微波加热 20 min，p-mTOR(Ser2448)(1:200)和p-A kt(1:25)—抗4C孵育过夜，二抗室温孵育 30 min，二甲基联苯胺（D A B)显1 ~ 10 min，苏木 精染核1min，中性树脂封片。
2.4 W S T-1比法P C K大鼠胆管上皮细胞经雷 帕霉素（0、0. 1、0.5、2 mg•L-1)和 PP242(0、0. 1、0. 5、2 .m d•L-1)处理 24、72、120 h后，用 WST-1比法测定。500 nmd•L-1 3-M A预处理P C K大 鼠胆管上皮细胞1h后，与2 .m o•L—1PP242联合 处理24 h，检测PP242处理后对胆管上皮细胞增殖 的影响。
2.5 A n n e x i n V/P I染检测细胞凋亡将细胞接种于35 m m培养皿，待细胞长到70b左右时，用 药组用药处理24 h，阳性对照组加入200 .m〇l•L^的H2O2处理24 h后，常规消化收集细胞，进行 Annexin V-F IT C和P I染，流式细胞仪进行检测。
2.6免疫蛋白印迹实验P C K大鼠胆管上皮细胞 用 PP242(0、0.1、0.5、2 .m o•L-1)处理24 h，提取 细胞总蛋白，加入蛋白裂解液（T-PE R)。蛋白定量 后，将40 .g蛋白经梯度胶电泳分离，电转至PVDF 膜上，Akt(1:1000)、p-Akt(1:1000)、4EBP1 (1:1 000)、p-4EBP1(1:1 000)、LC3 (1:500)、Rictor(1:1 000)和 Beclin-1(1:500)4C孵育过 夜，加H R P标记二抗室温孵育1h，E C L发光试剂盒 显，Chem iDOC成像系统拍照，Image J软件进行结 果分析。
2.7免疫荧光染细胞接种于8孔细胞培养玻 片，2 .m o•L-1PP242处理24 h，用4b多聚甲醛 固定，用0• 1b的Triton X-100处理10 min，血清封 闭，LC3抗体（1:200)4°C孵育过夜，D A P I染细胞 ，封 拍照 。
2.8 L C3、R ic to r和 B e c lin-1 基因沉默实验LC3、
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Tab 1 In te rf ere n c e se qu e n c es of L C3，B ecli n-l a n d R ict or
Gene Sense strand Antisense strand
LC3 5 LGGUAACUGACAAAGUGAAATTG ^ 5 LUUUCACUUUGUCAGUUACCAGG，Beclin-1 5 ^GCGAGAAUAUAGUGAAUUUTTG k 5 ,-iVAAUUCACUAUAUUCUCGCTG-3 ^ Rictor 5 ^-CCGGCGAAUCAGAACAUUUTTG k 5 ^-AAAUGUUCUGAUUCGCCGGTTG'
Rictoi•和Beclin-1的siR N A和阴性对照均购自Qia-gen，干扰序列T a Q1)SiR N A转染HiP-erF ect转染试剂，按试剂盒说明作。P C K大鼠胆管上皮细胞24 h，换 DMEM/F-12培养液、siRNA (10 n m o l L-1)和 3 .L HiPerFect转 染试剂液的混合液，继续培养72 h。
2.9 E L I S A检测ssDNA E L IS A实验是根据甲酰
细胞的感受性，选择性地定检测细胞中的单链DN A(single-strand D N A，ssDNA)的检测 方法。P C K大鼠胆管上皮细胞用2 .m=•L;1b PP242处理24 h后，收集细胞上清液，离心后，将样本按1:100稀释，
微本处理30 min，标抗人I g G抗体处理30 min，物显剂15 min()，止液后，波长仪在450 n m处检测，析，以大于0. 1IU •L-1为阳性。
2.10 3D细胞培养将细胞混悬于M atrigel中，细 胞均勻接种到24 中，待M atrigel凝，加入常规培养液培养至d 6，更换含有100 nm= •L-1'帕霉素和2 .m= •L-1PP242的培养液继续培养72 h，换液后d 0、3，每视野选择3 ~ 5个细胞球拍照记录，并用Image J分别测量d 0、3同细胞球的直径，：/%= (d 3直-d 0直径）X100%。
2.11统计学处理实验数据应用SPSS 20. 0和 Graphpad Prism5. 0统计学软件进行处理。数据均< ± s表示；据较采用f检验，多组间较采用单因素方析，较采用SNIK T检验。
3结果
3.1 p-m T O R和p-A k t蛋白在P C K大鼠胆管上皮细胞中呈高表达Fig 1大鼠染结果显示，p-m TO R和p-Akt t正常大鼠胆管上细胞中呈弱阳性，P C K大鼠胆管上皮细
胞中 阳性 。p-mTOR阳性颗粒主细胞和胆管上皮细胞的细胞核和细胞质，而 p-A k t蛋白主细胞和胆管上皮细胞的细胞。
3.2雷帕霉素和PP242对胆管上皮细胞增殖的影响正常和P C K大鼠胆管上皮细胞分别用0、0. 1、
p-mTOR p-Akt
F i g 1 Exp ressi on of p-mTOR and p-Ak t i n b il e du c t e p it h eli al
cell s e xam i n e d by i mmunoh istoc h e m istr y ( x200)
0. 5、2 mg •L_1的雷帕霉素和0、0. 1、0. 5、2 .mol •L—1的PP242处理24、72、120 h后发现，与对照组相比，雷帕霉素和PP242药物处理后的胆管上皮细胞的 受到明显抑制，且浓性（P<0.05)。在同一时间、同一浓度下，PP242比雷帕霉素的抗增果更明显（F ig2A、2B)。
3.3 雷帕霉素和PP242下调PI3K/A kt/m T O R信号通路相关蛋白的表达不同浓度的雷帕霉素和PP242处理P C K大鼠胆管上皮细胞24 h后，p-Akt 和p-4EBP1的蛋白表达水平随着药物浓度的增高而降低，且在2 .m= •L—1时抑制效果最为明显。在相同浓度作用下，PP242对磷酸化A k t和4EBP1的抑制效果更明显（Fig2C、2D)。
3.4 PP242诱导P C K大鼠胆管上皮细胞凋亡流式细胞术结果显示，PP242组细胞凋亡率明显高于对照组（Fig 3 A)。sDNA E L I S A实验结果显示，PP242组细胞凋亡率明显高于对照组（Fig 3B)。蛋 白印迹实验结果显示，cleaved caspase-3 明显上调（Fig 3 C)。以上结果提示，PP242可诱导P C K大 鼠胆管上皮细胞。
3.5 PP242诱导P C K大鼠胆管上皮细胞自噬蛋白免疫印迹结果显示，0、0. 1、0.5、1、2 .m= •L-1 PP242作用于P C K大鼠胆管上皮细胞24 h后，随着 药物浓度的增加，自噬标识蛋白LC3-II/ LC3-I的比 值以及Beclin-1呈逐渐升高的趋势，表明PP242能 诱导P C K大鼠胆管上皮细胞发生自噬，且呈
浓
中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2018 Sep；34(9)•1221 •
PCK 。Rapa PP242
0.10.5 20.1 0.512I—|p-4E B P I/4E B P l
P-A k t/A k t
Con Rapa PP242
Fig 2 Effect o f rap am ycinan dP P242 o n viab ility o f bile duct epithelial cells a n d p ro tein lev el o f P I3K/A k t/m T O R sign al pathway “±s，n= 3 ) A,B:T he effect of rap am ycin (m g•L_1)an d PP242 (.mol•L_1)o n p ro liferatio n1bile duct epithelial cells d etected by W ST-1assay;#P< 0.05 224 h co n tro l;#P<0•05 272 h control;"P<0•05 2120 h con trol.C，D:T he effect of rap am ycin a n d PP242 o n th e levels of P I3K/Akt/m TO R sign aling path w ay-related p ro tein s i n th e PC K rat cholangiocytes detected by W estern blot. *P<0. 05 con trol.
性（F i g 3D)。染结果显示，与对照组相比，2 .m d •L-1PP242处理组细胞胞质中LC3绿 颗粒含量明显，也明显i
(F i g3E)0
3.6 m T O R抑制剂抑制P C K大鼠胆管上皮细胞成球能力3D细胞培养结果显示，PP242组在处理72 h，与对照，细胞成球明显受到抑制（F i g4A、4B)。蛋白印迹结果显示，R ic t oi•基因沉 默 明显下调（F i g4D)。
探寻mTORC2对细胞生长的抑制作用，使
R N A处理mTOR C2复合物R ict o r，结果发现，R ic t or 基因沉默对P C K大鼠胆管上皮细胞成球并未生明显影响，与雷帕霉合作，细胞的球能力明显受到抑制（F i g4C、4E)。提示mTORC1和mTOR C2共同抑制可明显降低P C K大 鼠胆管上皮细胞的成球能力，mTORC1/C2抑制剂PP242可明显抑制胆管上皮细胞的增殖。3.7 L C3、B ecli n-1 si R N A和 3-M A可逆转 PP242对P C K大鼠胆管上皮细胞增殖的抑制效应为了观察PP242抑制胆管上皮细胞增殖过程中自噬的作用，使用LC3和Beclin-1基因沉默方法及自噬抑制剂3-M A后，检测PP242对P C K大鼠胆管上皮细胞 的影响。LC3基因沉默效果染方法鉴定，结果显示，LC3基因沉默后，细胞质内的绿颗粒明显减少（Fig 5A)) Beclin-1基因沉默后，印迹方法鉴定，结果显示，Beclin-1基因沉默后其表达明显下调（Fig 5B)。
LC3和Beclin-1siR N A对P C K大鼠胆管上皮细胞活力的影响甚微，而与PP242共同处理可明显增加细胞增殖活力（P<0. 05)，见Fig5C、5D。单独使
0. 5 .m o •L—1 3-M A时，对大鼠胆管上皮细胞活力的影响甚微，但3-M A与PP242共同处理后，减弱 PP242对细胞活力的抑制效果（P < 0. 05 )，见Fig 5E。上述结果提示，PP242诱导的自噬是抑制PCK
0 0.10.52
PP242
A
24 h 國72h 國120h Control
刘特B150「□ 24 h
圓72h
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Control
PP242
2 ^imol-L
Fig 3 Effect o f PP242 o n a p o p to sis and autophagy o f P C K r a t cholangiocytes
A：The effect of PP242 ( .m o l • L 1) on apoptosis detected by Annexin V/P I double staining；B!The effect of PP242 on apoptosis detected by
ELISA; C!The expression of cleaved caspase-3 increased 1the PCKrat cholangiocytes treated with P P242; D!The bile duct epithelial cells treated with different concentrations of PP242 and rapamycin (mg • L 1) for 24 h, the level of Beclin-1 and the ratio of pression of LC3 increased in PCK rat cholangiocytes treated witli PP242 (immunofliaorescence staining, x 400) /
胆管上皮细胞生长的主要机制之一。
4讨论
C aroli病，即先天性肝内胆管扩张症，其病因不明，在病中出 并发症，且7%的患者可发管癌[10]，目上尚无有效的
方案。H3K/Akt/m TO R信号通与细胞、凋和自噬相关的信号通路[11]。本研究发现，p-Akt 和p-mTOR的 P C K大鼠胆管上皮细胞中明显增高，提示A kt/m TO R信号通路的异常活 导致P C K大鼠胆管上皮细胞过度生长的机制之。
雷帕霉素是一种对mTORC1有效的m T O R抑 制剂，mT0RC2不感。雷霉，mTORC2磷酸化Akt 473位点，负反馈激活PI3IK A kt/m TO R通路，导部分患者雷帕霉素数
发生复发和耐药，使雷帕霉的 受到限制[12]。PP242是一种A T P竞争性m TORCl/2 重抑制剂，其主点是mT0RC2，同时抑制mTORC1 和 mTORC2。Qin 等[13]研究发现，PP242 可通过诱导凋亡和自制 癌细胞的生长。本研究发现，PP242和雷帕霉素两者均可抑制P C K大 鼠胆管上皮细胞的，且 -浓性，其机制是下调PI3K/A kt/m TO R下 p-A k t和p-4EBP1的表达。而同等浓度下，PP242的抑制效果明显强于雷帕霉素。在PP242处理胆管上皮细胞，球明显减弱。我们研究发现，单雷帕B
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