用圆二光谱研究蛋白质与小分子作用后的构象变化
一． 实验目的
1. 了解圆二（CD）光谱研究蛋白质二级构象的基本原理和方法。
二． 实验原理
1. CD光谱的基本知识
圆二性是研究分子立体结构和构象的有力手段。在一些物质的分子中，没有任意次旋转反映轴，不能与镜像相互重叠，具有光学活性。电矢量相互垂直，振幅相等，位相相差四分之一波长的左和右圆偏振光重叠而成的是平面圆偏振光。平面圆偏振光通过光学活性分子时，这些物质对左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，就是该物质的圆二性。
圆二性用摩尔系数系数差ΔεM来度量，且有关系式：ΔεM = εL – εR，其中，εL和εR分别表示左和右偏振光的摩尔吸收系数。如果εL – εR >0，则ΔεM为“+”，有正的圆二性，相应于正Cotton效应；如果εL – εR <0，则ΔεM为“-”，有负的圆二性，相应于负Cotton效应。
由于这种吸收差的存在，造成了矢量的振幅差，因此从圆偏振光通过介质后变成了椭圆偏振光。圆二性也可用椭圆度θ或摩尔椭圆度[θ]度量。[θ]和ΔεM之间的关系式：
[θ]=3300*ΔεM
圆二光谱表示的[θ]或ΔεM与波长之间的关系，可用圆二谱仪测定。一般仪器直接测定的是椭圆度θ，可换算成[θ]和ΔεM：
猎狐杨建结局[θ] = 100θ/cl
ΔεM = θ/33cl
其中，c表示物质在溶液中的浓度，单位为mol/L；l为光程长度（液池的长），单位为cm。输入c和l的值，一般仪器能自动进行换算，给出所需要的关系。
圆二光谱仪需要将平面偏振调制成左、右圆偏振光，并用很高的频率交替通过样品，因而设备复杂，完成这种调制的是电致或压力致晶体双折射的圆偏振光发生器（也称Pocker池或应力调制器）。圆二谱仪一般采用氙灯作光源，其辐射通过由两个棱镜组成的双单器后，就成为两束振动方向相互垂直的偏振光，由单器的出射狭缝排除一束非寻常光后，寻常光由CD调制器制成交变的左圆偏振光、右圆偏振光，这两束圆偏振光通过样品产生的吸收差由光电倍增管接受检测。
测试时要通入氮气赶走管路中的水蒸气和光源产生的臭氧（臭氧会腐蚀反射镜）。
2. CD测蛋白质二级结构的基本原理
蛋白质是由氨基酸通过肽链组成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质中氨基酸残基的排列次序是蛋白质的一级结构，而肽链中局部肽段骨架形成的构象称为二级结构，二级结构是靠台联股价中的烫机上的氧原子和亚胺基上的氢之间的氢键来维系的，根据肽链的旋转方向与氢键之间的夹角不同，蛋白质的二级结构主要分为：α螺旋、β折叠、γ转角和任意度较大的无规卷曲几类。这些二级结构的不对称性，使蛋白质具有光学活性，也就具有特征CD谱。α螺旋在222 nm和208 nm处有负Cotton效应，表现出两个负的肩峰谱带，在靠
刘力扬资料近192 nm有一正的谱带。β折叠的CD谱在216 nm有一负谱带，而在195-200 nm有一正谱带。γ转角和无规卷曲都有特征的CD谱。根据所测得的蛋白质的CD谱，以及已知结构的标准谱图，可计算这几种二级结构的含量，从而推断出蛋白质的二级构象。
由于222和208 nm是α螺旋的特征峰，最早估计α螺旋的含量从这两点的平均椭圆度得到：
fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000
或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000
其中，fα是α螺旋所含的残基与整个蛋白质分子的残基数的百分比；[θ]222和[θ]208分别只在222和208 nm时的摩尔椭圆度。其他常数是根据实验推出的经验值。由于上式仅考虑了单波长时α螺旋的贡献，而忽略了其它组分对[θ]的贡献，具有一定的误差，但可以利用上面两式做快速简单的推算。
三．仪器与试剂
仪器：JASCO715型号的CD分光光度计； 25 mL容量瓶；1 mL分度吸量管
试剂：牛血清白蛋白（BSA）（A.R.）；VB12（A.R.）；缓冲剂（A.R.）pH=4.0的HAc-NaAc和pH=8.0的磷酸盐体系；蒸馏水
四． 实验步骤
1. 准备样品
准确配制7.5 μg/mg的VB12溶液、5 μg/mg牛血清白蛋白溶液、pH=4的牛血清白蛋白溶液、pH=8的牛血清白蛋白溶液、pH=4的牛血清白蛋白+ VB12溶液和pH=8的牛血清白蛋白+ VB12溶液。蛋白质溶液中加入VB12后，需要放置一段时间，使蛋白质与VB12分子作用达到平衡。
2. 开机
打开高纯氩气，通入光路。打开计算机，进入操作界面。开启氙灯，等约30 min，待仪器充分预热后，方可使用。
3. 测试
将光路径为1 cm的样品池放入样品室中，进入测试界面，输入测试参数：灵敏度1000 mdeg；扫面范围250-200 nm；扫速50 nm/min；响应时间2 s；响应波长宽度1.0 nm；扫描次数1次。先测试蒸馏水背景，再分别测试配制的六份溶液。
4. 关机
打开样品室，取出样品池；退出操作界面，关闭氙灯；关闭氮气，关闭主机电源；关闭计算机和打印机；清洗样品池。
五．数据处理
图1. BSA
使用公式：BSA平均分子量为67000，配制的BSA样品浓度为10ug/ml,换算得到BSA浓度为1.4925*10-7 mol/L [θ] = 100θ/cl，其中c =1.4925*10-7 mol/L，l = 1cm-1
根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到
fα，222 = -（-16096 + 3000）/ 33000=39.68%
fα，208 = -（-17983 + 4000）/ 29000=48.22%二级VB
图2. BSA，PH=8
根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到
fα，222 = -（-15955 + 3000）/ 33000=39.26%
fα，208 = -（-17213 + 4000）/ 29000=45.56%
图3.BSA，PH=4
根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208崔胜贤网王 不是替身 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到
fα，222 = -（-16472 + 3000）/ 33000=40.82%
fα，208 = -（-17865 + 4000）/ 29000=47.81%
图4. BSA +VB12
根据杨氏公式fα，222 = -（[θ]222 + 3000）/ 33000或fα，208 = -（[θ]208 + 4000）/ 29000估算α螺旋的含量得到
fα，222 = -（-16236 + 3000）/ 33000=40.10%
fα，208 = -（-21899+ 4000）/ 29000=61.72%
六．结果讨论
1. 从四张图中都能看到BSA在222nm和208nm存在两个负Cotton效应的峰，而在195nm处存在一个正Cotton效应的峰，这都是α螺旋的特征峰，证明存在α螺旋。从四组实验结果（如下表所示）可看出，用坤音娱乐fα，222和fα，208计算得到的结果不完全一致，但在误差范围内可认为一致。PH=8时，BSA溶液α螺旋的含量变化不大，因为比较接近人体正常PH范围（7.35～7.45），当PH=4时，α螺旋的含量升高，且变化幅度大于PH=8，说明PH越大，α螺旋越不稳定，含量越低，酸性条件有利于α螺旋的稳定性。而且，PH变化越大，α螺旋的含量变化越大。比较BSA+ VB12溶液和BSA溶液α螺旋的含量可知，由于VB12中钴离子与BSA发生配位作用，从而造成α螺旋的含量升高。
BSA溶液 | BSA，PH=8 | BSA，PH=4 | BSA+ VB12溶液 | |
fα，222 | 39.68% | 39.26% | 40.82% | 40.10% |
fα，208 | 48.22% | 45.56% | 47.81% | 61.72% |
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