⒊ 免疫组化染步骤
许魏洲演唱会⑴ 0.01 mol/L PBS液中洗涤3次，每次10min。
⑵ 用0.3%过氧化氢-甲醇室温中处理切片5～30min，封闭内源性过氧化物酶。
⑶ 充分洗涤后，入0.01 mol/L PBS洗3次，每次10min。
⑷ 血清白蛋白中孵育30min，减少非特异性反应。失恋阵线联盟 苏妙玲
⑸ 0.3% Triton-X-100中作用20min，增加细胞膜的通透性，用0.01 mol/L PBS洗3次，每次10min。
⑹ 同时加兔抗Fos蛋白和鼠抗GFAP抗血清，在4℃中孵育48h或室温24h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min，振洗。
⑺ 生物素标记的羊抗兔IgG和驴抗鼠IgG (根据公司的说明，选择适宜的稀释度)室温中孵育2h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min。
⑻ ABC复合物(根据公司的说明，选择适宜的稀释度)孵育2h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min。
⑼ 蒸馏水迅速冲洗3次，进行葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺加强法反应，呈深蓝。
⑽ 选取呈好的切片，漂洗后再加入兔（或鼠）抗TH抗血清，4℃中孵育48h或室温24h，用PBS洗3次，各10min，振洗。
⑾ 生物素标记的羊抗兔（或驴抗鼠）IgG室温中孵育2h，用PBS洗3次，各10min。
⑿ ABC复合物孵育2h（室温），PBS洗3次，各10min。
⒀ 蒸馏水迅速冲洗3次，进行葡萄糖氧化酶-DAB棕法呈。
⒁ 呈的切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封片，光镜下观察并摄像。
⒋ 对照实验
范志博年龄⑵ 替代对照：用制备第一抗体相同种属动物的正常血清替代一抗或用二抗相同种属动物的正常血清替代桥抗体，染结果应为阴性。
⑶ 自身对照：用同一组织切片与靶抗原无关的其它结构作对照。阳性与阴性结构在同一视野中，相互印证。
⑷ 阳性对照：同时染已知靶抗原阳性标本，以排除操作过程失误所致的假阴性。
⑸ 吸收对照：用几倍甚至10倍于抗体浓度的抗原与抗体溶液混合，后将此液过滤，并用于对切片反应，若结果为阴性，说明抗体是特异性的。
四、【实验结果分析与处理】
（一）对染结果的分析
洗葡萄的方法一般认为在严格控制染条件、选择特异性抗体等条件下，所得的阳性结果才有积极意义。而所得结果为阴性时，不一定意味着该物质或抗原不存在，即不能排除实验过程所致的抗原丢失或抗体选择不当等引起的假阴性。结果分析首先从切片质量开始，判断固定是
否合适、切片是否平滑、非特异性着强弱等，再从低倍至高倍顺序观察实验标本，预期阳性部位是否被染，不该含此类物质的部位是否阴性等。同时应结合对照实验做出正确的判断。
（二）假阳性及其处理
组织成分与各种染试剂及抗血清之间的非特异结合称为假阳性，其主要原因和处理方法如下：
⒈ 内源性过氧化物酶活性：用80%甲醇（0.01mol/l PBS 缓冲液配置）+ 0.3% H2O2孵育标本15～20min，能抑制此假阳性。
那些动物冬眠⒉ 第一抗体不纯：抗体不纯是指抗体含有杂质抗体或血清。其非特异抗体吸附到组织细胞上造成假阳性。去除方法：一是尽可能高的稀释抗体，减低非特异抗体的浓度；二是一抗孵育之后用PBS充分冲洗；三是在加一抗前加正常血清，以封闭非特异结合位点。
⒊ 第二抗体：将IgG从血清中分离出来，其中同时存在四种成分：一是特异性抗IgG；二是作为抗原的IgG不纯所产生的非特异性抗IgG；三是供体血循环中其它的IgG；四是非IgG蛋
白。除特异性抗IgG外，其它成分可以通过与组织结构的特异性交叉反应或通过非特异的疏水键与组织细胞结合，产生非特异性染。去除方法基本同（2）。
⒋ 游离醛基：醛类固定的组织切片上，存在游离醛基，它能与蛋白质（含IgG）间非特异性结合，导致假阳性。用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育切片，可封闭。
（三）阳性染的确认与数据采集
阳性染结果一般应具备以下特征：
⒈ 染均匀，胞核、胞浆、胞膜、纤维、突起等形态结构完整。
⒉ 阳性染产物的特异性分布，有核团或细胞学定位差别。
⒊ 多重染的阳性产物可以清晰分辨。如：神经元Fos阳性胞核是深蓝，TH（或VP）阳性胞浆呈棕，HRP示踪剂产物是棕胞浆内的黑的颗粒状，GFAP阳性胶质细胞呈深蓝。（见图20-1-1）
⒋ 阳性结果在光镜下观察，根据需要摄像或半定量分析。
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五、【注意事项】
⒈ 选择适当的固定液，掌握恰当的固定时间和方法，最大限度地保持组织的细胞结构和酶的活性。
⒉ 实验组和对照组要合理配伍和处理。
⒊ 动物标本或切片尽量使用新鲜的，需长时间保存则存放在-70℃冰箱。
⒋ 抗体按照说明保存，并选择合适的工作浓度使用，忌反复冻融。
⒌ 选择适当的孵育时间与温度，切片应充分与抗体接触，防止抗体风干、流失。
⒍ 切片每次漂洗要彻底，防止交叉反应。
⒎ 呈反应过程应随时在镜下观察反应结果并及时终止反应。
⒏ 第一、二次的呈不宜过深，以免影响结果的观察。
⒐ 切片要晾干后再脱水，透明，封片。
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