2010No．5Serial No．218
China Brewing
196U/g 原料时，蛋白质分区并未得到改善，随着蛋白酶添加剂量的增加，效果并未明显提高。因此，中性蛋白酶添加剂量为300U/g 原料时啤酒非生物稳定性相对较好。参考文献：
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海洋约占地球表面的71%，其中蕴藏着丰富的微生物资源。海洋环境的特殊复杂性使海洋微生物为了适应生存而产生不同结构和功能的天然活性物质，酶类就是其中重要一种[1]。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称。按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分为α-淀粉酶（α-amylase ，EC3.2.1.1）、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。淀粉酶广泛存在于微生物、植物和动物体中。目前已广泛应用于食品、
发酵、畜牧业生产、谷物加工、纺织、造纸、轻化工业、医药和临床分析等领域[2-4]。现已有大量有关土壤细菌产淀粉酶的文献报道[5-8]，但是有关海洋细菌产淀粉酶的研究报道较少。本课题组在筛选海洋微生物的研究中，分离出一株具有较强产淀粉酶活性的菌株。并对该菌株产淀粉酶的发酵条件进行了研究，旨在为该菌株的应用开发提供依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种
取自威海的金海滩、靖子、小石岛、前双岛、文登南海的菌种共13株，编号W1~W13。1.1.2培养基
2216E 培养基：蛋白胨5g ，酵母浸膏1g ，磷酸高铁0.01g ，陈海水1000mL ，pH 7.2~7.6。
平板筛选培养基：可溶性淀粉10g ，琼脂10g~20g ，硝酸铵5g ，陈海水1000mL ，pH7.2~7.6
种子培养基：蛋白胨5g ，酵母膏3g ，葡萄糖6g ，陈海水1000mL ，pH7.2~7.6
摇瓶发酵培养基：麸皮5g ，蛋白胨5g ，陈海水1000mL ，pH 值自然。
1.1.3主要试剂及仪器
主要试剂：葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶苯酚、可溶性淀粉、琼脂、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。
主要仪器：752型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
一株产淀粉酶海洋菌的筛选及发酵条件的研究
张继千，郑冰心，吴
波，邵云云，李川川，朱启忠*
（山东大学威海分校海洋学院，山东威海264209）
摘要：研究筛选产淀粉酶海洋菌并对发酵条件进行了优化。采用3，5-二硝基水杨酸试剂显法对菌种复筛；研究了碳源、氮源、各
种理化因素等培养条件对细菌产淀粉酶的影响。确定W11菌为研究菌，初步鉴定为弧菌；最佳碳源为麸皮，最佳氮源为蛋白胨，最适初始pH 值为7.04~7.70。培养温度、接种量、装液量对细菌产酶有较大影响，正交试验表明：麸皮10g/L ，蛋白胨10g/L ，250mL 三角瓶中装液75mL ，温度33℃时，酶活可达到325.14U/mL 。比未优化前提高了2.71倍。关键词：淀粉酶；海洋菌；发酵条件中图分类号：Q93-331
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）05-0064-03
Screening,optimization of fermentation conditions of an amylase-producing marine bacterium
ZHANG Jiqian,ZHENG Bingxin,WU Bo,SHAO Yunyun,LI Chuanchuan,ZHU Qizhong*
(Marine College of Shandong University at Weihai,Weihai 264209,China)
Abstract:Screening of marine bacterium and optimization of fermentation conditions for amylase production were studied.The strain was finally de-termined with chtomogenic method with 3,5-dinitrosalicylic acid and effects of carbon source,nitrogen source,and physicochemical factors on pro-duction of amylase by bacterium were also studied.Strain W11was used for further study and it was preliminarily identified as Vibrionaceae .Opti-mum sources of carbon and nitrogen were wheat bran and peptone,respectively with initial pH at 7.04~7.70.With orthogonal test,the optimum con-ditions were determined as bran 10g/l,peptone 10g/l,with 75ml medium in 250ml shaking flask and inoculated under 33℃.Under the optimum conditions,enzyme activity could reach 325.14U/ml,which was 2.71times as normal conditions.Key words:amylase;marine bacterium;fermentation condition
收稿日期：2010-01-12
基金项目：山东大学威海分校重点科研项目（A09002）
作者简介：张继千（1989-
），男，山东济南人，主要从事酶工程学研究工作；朱启忠*，教授，通讯作者。℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃
Research Report
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中国酿造
2010年第5期总第218期1.2产酶菌种的分离
初筛：将13株菌种点于平板筛选培养基，30℃恒温培养7d ，测量透明圈、菌落直径比。
复筛：将初筛菌株在试管斜面30℃培养1d 后，接入复筛摇瓶培养基（250mL 三角瓶装70mL 培养基），150r/min 、30℃培养4d ，测定酶活力，选定酶活力最高的菌株为目的菌。1.3淀粉酶活测定
酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸试剂显法[9]。以1mL 粗酶液在45℃、pH 7的条件下每分钟水解淀粉产生相当于1μg 葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位（U ）。
1.4发酵条件的优化
采取单因素试验，分别改变培养基中碳氮源种类以及培养初始pH 值、接种量、装液量和发酵温度等条件，150r/min 摇床培养48h ，测定发酵液的淀粉酶活性，再进一步用正交试验法研究最佳培养条件。2结果与讨论2.1产淀粉酶菌株筛选
取自威海金海滩、靖子、小石岛、前双岛、文登的菌种共13株，
编号W1~W13，经筛选，W11菌种菌落表面光滑有光泽、边缘整齐、稍有隆起、浅乳白、革兰氏阴性菌，在硫柠胆蔗琼脂培养基（TCBS 培养基）上生长良好，初步鉴定为弧菌。摇瓶培养条件下产酶量最大，为119.82U/mL ，故将其作为进一步研究的试验菌。2.2产酶条件的研究
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2.2.1碳源对细菌产酶的影响
在液体培养基中分别用待测碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、琼脂、麸皮）为唯一碳源，30℃、150r/min 培养48h 后测定淀粉酶活，结果（附图A ）可以看出，淀粉、麸皮等含淀粉较多的碳源条件下细菌产酶量较多，可见产的酶为诱导型。麸皮为碳源时产酶量最大，为135.32U/mL ，可能是因为麸皮为有机碳源，成分复杂，营养丰富，含有细菌生长需的多种营养物质。
2.2.2氮源对细菌产酶的影响
由于此菌以麸皮为碳源时有利于淀粉酶的分泌，所以氮源试验时以麸皮为固定碳源；待测氮源为硫酸铵、硝酸铵、尿素、牛肉膏、蛋白胨，30℃、150r/min 摇床培养48h 后测定淀粉酶活，结果（附图B ）可以看出，蛋白胨为氮源时细菌产酶量最大。在进行后面的单因素试验时采用的培养基配方为麸皮5g ，蛋白胨5g ，陈海水1000mL ，pH 值自然。2.2.3初始pH 值对细菌产酶影响
改变发酵培养液初始pH 值（6.5~9.5），每250mL 摇瓶装70mL 液体培养基，接种量5%，30℃、150r/min 培养48h 后测定酶活力，结果（附图C ）可以看出，pH 值为6.8~7.5时菌株生长较好，
pH 值为7.0时产酶量最高，酶活为148.84U/mL 。2.2.4装液量对细菌产酶影响
改变发酵装液量（25mL 、50mL 、75mL 、100mL 、125mL ），接种量5%，30℃、150r/min 培养48h 后测定酶活力，结果（附图D ）可以看出，装液量为50mL 时，细菌产酶量最大，酶活为276.39U/mL ，当装液量超过75mL 时细菌产酶量急
研究报告
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剧下降。
2.2.5接种量对细菌产酶的影响
改变发酵接种量（0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%），每250mL摇瓶装70mL液体培养基，30℃、150r/min培养48h 后测定酶活力，结果（附图E）可以看出，接种量为5%~15%时细菌产酶量较多，其中接种量为10%时，细菌产酶量最大，酶活为243.07U/mL。
2.2.6温度对细菌产酶影响
改变发酵温度（22℃、27℃、30℃、33℃、37℃、41℃），每250mL摇瓶装70mL液体培养基，接种量5%，150r/min培养48h后测定酶活力，结果（附图F）可以看出，温度为27℃~ 37℃时细菌生长较好，而在33℃时细菌产酶量最大，酶活为191.2U/mL。
2.2.7碳源、氮源、装液量、温度正交试验
将4种因素结合进行正交试验极差分析及方差分析，试验方案与结果见附表。结果表明，碳源对产酶量影响最大，其次为氮源。4种因素对淀粉酶产酶量影响顺序依次为碳源＞氮源＞温度＞装液量。碳源是影响产酶水平最主要的因素，菌株在不同浓度麸皮条件下培养，产酶水平有显著差异（p＜0.05），而其余因素的各水平虽然影响产酶结果，但差异无显著意义（p＞0.05）。最好方案应为A
3
B3C3D2，即麸皮10g/L，蛋白胨10g/L，温度33℃，装液量75mL。在该发酵条件下进行验证试验，酶活为325.14U/mL，比其他正交试验的各试验组结果都高，从而验证了正交试验优化发酵条件的可靠性。
3结论
随着工业的发展，具有新活性性质、来源不同的淀粉酶亟待开发。因此研究工作者们对耐酸性淀粉酶[10]、耐碱性淀粉酶、耐高温淀粉酶[5]、支链淀粉酶[11]、产物新型淀粉酶[12]等进行了研究。此外，由于深海微生物采样、分离培养的困难等多种因素的影响，国内外对深海微生物的研究还处于起步阶段，对海洋产淀粉酶研究较少[13-14]。研究从海泥中筛选到13株产淀粉酶的海洋菌。经复筛，比较选取W11菌株为进一步研究菌株。麸皮、蛋白胨分别为碳氮源时细菌产酶量最大，最适pH值为7.04~7.70。正交试验结果表明，麸皮10g/L，蛋白胨10g/L，装液量75mL，温度33℃，是细菌产酶的最优发酵条件，此时酶活为325.14U/mL，比未优化前提高了2.71倍。
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附表碳源、氮源、装液量和发酵温度4因素正交试验设计与结果Attached table.Orthogonal test data of carbon source,nitrogen source, medium volume in250ml-flask and culture temperature
试验号A麸皮/
（g·L-1）
B蛋白胨/
（g·L-1）
C装液量/
mL
D温度/
℃
酶活/
（U·mL-1）
11（0.025）1（0.025）1（25）1（30）124.05 21（0.025）2（0.05）2（50）2（33）218.15 31（0.025）3（0.1）3（75）3（37）206.87 42（0.05）1（0.025）2（50）3（37）181.48 52（0.05）2（0.05）3（75）1（30）192.27 62（0.05）3（0.1）1（25）2（33）292.71 73（0.1）1（0.025）3（75）2（330）316.82 83（0.1）2（0.05）1（25）3（37）317.17 93（0.1）3（0.1）2（50）1（30）265.33 K1183.02207.45244.64193.88
K2222.15242.53221.65275.89
K3299.77254.97238.65235.17
误差平方和21186.583643.51853.4210088.62 R116.7547.5222.9982.01
F24.826*  4.269111.821Research Report
66··范冰冰怒怼华师大教授