基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第11期，第5201-5206页
研宄报告
Research Report
竹叶花椒肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与表达分析
关淑文口王毅”郝佳波2原晓龙2陆斌”
1西南林业大学林学院，昆明，650224; 2云南省林业和草原科学院，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，国家林业局云南珍稀濒特森 林植物保护和繁育重点实验室，昆明，650201
* 共同通信作者，***************;*******************
摘要肉桂酸辅酶A还原酶(c i n n a m o y l-C o A reductase,C C R)在木质素生物合成途径中起着关键作用。本 研究依据转录组数据设计特异性引物，米用R T-P C R方法从竹叶花椒(Zoni/i m y/a m o r m o t o n)中克隆得到一■个 全新的C C/?基因的全长c D N A序列，命名为而C C/?。序列分析结果表明，Z a C C尺包含完整的c D N A开放阅 读框(O F R)，由990 b p组成，编码329个氨基酸。B l a s t比对结果显示该蛋白质属于C C R家族蛋白；系统进化 树结果显7K竹叶花椒o r m o/u m)与芸香科植物甜澄(Sw
eet orange，蜜相(Satsuma m a n d a r i n，等亲缘关系较近。荧光定量P C R检测显示，Z a C C/?在竹叶花椒中的表达量从大到小分别为：嫁接树的茎、实生树的茎、嫁接树的叶、实生树的叶。
关键词竹叶花椒(Z a加a/7n_m)，肉桂酰辅酶A还原酶，生物信息学分析
Cloning and Expression Analysis o f Cinnamoyl-CoA Reductase Gene from Zanthoxjlum armatum
G u a n S h u w e n u W a n g Y i2*H a o Jiabo2Y u a n X i a o l o n g2L u Bin2*
1College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming, 650224; 2 Laboratory of Forest Plant Cultivation and Utilization, Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration, Yunnan Academy of Forestry & Grassland, Kunming, 650201
*Co-correspondingauthors,***************;*******************
DOI: 10.13417/j.gab.039.005201
Abstract C i n a m o y l-C o A reductase plays a key role in lignin biosynthesis p a t h w a y.In this study,w e designed specific primers based on transcriptome data and cloned a novel full-length c D N A sequence of CCR gene from Zanthoxjlum armatum b y R T-P C R,n a m e d ZaCCR.Sequence a
nalysis s h o w e d that ZaCCR contains a complete o p e n reading frame(O R F),consisting of990 b p,encoding329 a m i n o acids.Blast comparison results s h o w e d that the protein belongs to C C R family,and phylogenetic tree results s h o w e d that Zanthoxylum armatum w a s closely re­lated to Rutaceae plants such as sweet orange(Citrus sinensis)and satsuma mandarin(Citrus unshiu).Fluorescence quantitative P C R s h o w e d that the expression of Z a C C R in Zanthoxylum arm cU urn from large to small are:S t e m of grafted tree,stem of seedling tree,leaf of grafted tree and leaf of seedling tree.
K e y w o r d s Zanthoxylum armatum^C i n n a m o y l-C o A reductase(C C R),Bioinformatics analysis
花椒属于芸香科(R u­taceae)花椒属 (Za加/罵y/a m)植物，在世界上分布广 泛，中国南方和北方均有种植。花椒属植物在全世界约有250种，其中中国占39个种，14个变种。世界上 栽培花椒属植物的国家主要分布在东亚，而产量最高、栽培面积最大的国家是中国（毕君和曹福亮，2008,
基金项目：本研究由云南省科技厅重点研发项目(2018B B008)资助
引用格式：G u a n S.W., W a n g Y., H a o J.B., Y u a n X丄.，a n d L u B., 2020, C l o n i n g a n d expression analysis o f c i n n a m o y l-C o A reductase g e n e f r o m Zanthoxylum armatum, Jiyinz
uxue Y u Y i n g y o n g S h e n g w u x u e (G e n o m i c s a n d Ap p l i e d Biology), 39(11): 5201-5206
文，王毅，郝佳波，原晓龙，陆斌,2020，竹叶花椒肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与表达分析，基因组学与应用生物学，39(11): 5201-5206)
5202 基因组学与应用生物学
林业科技开发，22(3): 9-13)。竹叶花椒(Zrznf/uwjyZum o r m o f u m)不仅早实丰产、生长迅速，而且还具有盛产 期长、抗病虫性强、根系发达、耐干旱瘠薄和固土保 水保肥能力强等优点，被视为经济价值高、生态效 益好的经济树种，在退耕还林工程中被广泛栽植。其果实还是重要的调味料、香油料和中药材(张华和 叶萌,2010)。
木质素(Lignin)是一种广泛存在于维管植物中的 有机成分，由3种单体聚合而成，是细胞壁的基本组 成成分，参与细胞壁的木质化过程，因此可影响植物 的形态发育和抗倒伏能力，同时木质素也具有抗虫 的化学特性(于明革等，2003，山东农业大学学报(自 然科学版),34(1): 124-128)。其生物合成途径主要为 单体合成和储存、运输、聚合而成(魏建华和宋艳茹，2001，植物学报(英文版)，43(8): 771-779)。
研究表明，木质素单体在植物细胞质中合成，再 通过醚键、酯键或碳-碳键等化学键连接在一起，经
过转运，储存在相应的木质化沉积位点上，然后在细 胞壁中进行脱氢羟化，最后形成木质素(Kang et al., 2012)。木质素生物合成途径的第一个关键酶是肉桂 酸辅酶 A 还原酶(cinnamoyl-CoA reductase, CCR)，轻 基肉桂酸CoA酯的还原反应在肉桂酰辅酶A还原 酶的催化下生成相应的肉桂醛(主要将阿魏酰辅酶A 催化成松柏酸）（Van Acker et al_, 2014)。
目前己在多种植物中验证了 C C R基因的功能，其中发现植物体内木质素的含量及组成受C C R基 因的表达量的影响，从而植物的发育和表型也会相 应受到影响，表现为种子量减少、植株矮化、叶变 暗、茎变细、抗病、生长缓慢、抗逆等（侯维海等, 2017)。因此C C R基因是木质素合成途径中不可或缺 的影响因素。由于部分突变体的鉴定以及R N A i、转 基因、基因克隆等分子生物学技术不断得到发展，C C R基因的功能得到逐步深入的研究，对C C R基因 的功能研究已成为木质素合成途径研宄的一个热点 (董丽丽等，2016)。
当則己在斧菜〇4/^1*/77.^^廳〇/6似'1-)(吴落等，2〇16)、石偕(Auiica gron.L.)(董 等，2016)、芒麻(/?〇-e/tmeria nirea (L_)G a u d.)(唐映红等，2015)、青花菜 (B r a^i c a ofcracea var.italica)(李小艳等，2016)、丹参
m i,“o/r/iiza B u n g e)(陈尘等，2011)、茶树(C d-me/Zia sine m i s)(陈林波等，2016)等植物中成功克隆 出C C R基因，但目前未见到从竹叶花椒中成功克隆 出C C R基因。本研究对竹叶花椒C C R基因
进行克 隆与分析，为后续对木质素生物合成、代谢途径及 C C R基因表达调控的相关研究提供科学依据。1结果与分析
1.1 R N A提取和Z a C C/?基因克隆
利用植物总R N A提取试剂盒成功提取竹叶花 椒(■Zanf/MMcy/um a r m a/u m)嫁接树和实生树嫩梢的总 R N A后，反转录得到c D N A。以Z a C C R I F和Z a C-C R1R作为特异引物，成功克隆得到竹叶花椒(Z oti-i/ioxy/um a/TOo/w m)肉桂酿辅酶A还原酶基因。利用 N C B I O R F F i n d e r软件对测序结果进行序列分析，结 果显示Z a C C f t基因(登录号：M K953726)片段包含完 整的c D N A开放阅读框(O R F)，序列全长 990 b p，编 码含有329个氨基酸的蛋白质。
1.2竹叶花椒Z a C C T?基因蛋白序列分析
用在线程序O R F F i n d e r预测Z«C O?基因的开 放阅读框，P r o P a r a m预测Z a C C/?基因的理化性质。结果显示：该蛋白由329个氨基酸残基组成，其分子 量为35 680.65，等电点为5.93；根据克隆得到的Z f t-C C/?基因序列在B L A S T上进行比对后发现，用推断 得到的329个氨基酸序列与已知功能的甜橙(Sweet orange,Citrus^tt(Satsuma mand a r i n,Citrus
w m/iiu)、克里曼丁拮(clementine mandarin,Cifnw c/e m-e n h n a)和毛白杨(Chinese white poplar,t o
m e n-«osa)的C C R蛋白序列进行序列相似性比对，结果显 不：竹叶花椒(Z n/U/w M c y/u m.u r m a i u m)Z a C C R蛋白序列 与甜檀（S w e e t orange,Ciinw .s ine/wis)的C C R蛋白序 列相似性为 86.32%；与蜜柑(Satsuma m a n d a r i n,Citrus ■s/iiu)的C C R蛋白序列相似性为86.02%，与克里曼 丁結(Clementine m a n d a r i n,Citric cfcmerui/ia)的相似 性为 85.71%，与毛白杨(Chinese white poplar,PopiiZiw 幌)的相似性为71.00%。对竹叶花椒Z a C C R
蛋白序列分析发现，其存在由8个氨基酸组成的 N A D(P)结合基序“T G A N G F I G”，由7个氨基酸组成 的N A D P特异位点“Y P G T D A S”，由4个氨基酸组成 的N A D(P)结合位点“N I L D”和由8个氨基酸组成的 催化中心“K I W Y S M S K”(图1)。
将推导出来的Z a C C R蛋白序列在美国国家生 物技术信息中心(N C B1)进行比对，得到其他植物C C R
蛋白序列，用M E G A7中自带的Cluster W进行蛋白 序列多重比对后，用N e i g h b o r-joining算法（自检举
1 000次)绘制出竹叶花椒Z a C C R蛋白与其他植物的
C C R蛋白的进化树(图2)。结果显示竹叶花椒^^-
ormafiim)Z a C C R蛋白与甜接(Citrus■s iraemis，X P_006470778.1)、克里曼丁結c/e m e W r a%X P__
竹叶花椒肉桂酰辅酶A 还原酶基因克隆与表达分析5203
图3 Z r z C C /?分别在嫁接树和实生树的茎和叶中的表达情况 注：1: G _s t e m ：嫁接树的莖；2: G _l e a f ：嫁接树的叶；3: S _stem: 实生树的茎;4: S J e a f ：实生树的叶
Figure 3 T h e  expression o f  ZaCCR  g e n e  in ste m s  a n d  leaves o f  grafted a n d  seedling tr
ees respectively
Note: 1: G  stem: S t e m s  o f  grafted trees; 2: G  leaf: L e a v e s  o f  grafted trees; 3: S _stem: S t e m s  o f  seedling trees; 4: S_leaf:
L e a v e s  o f  seedling trees
zia
度一致，由此证明该蛋白属于CCR 蛋白家族。
通过对竹叶花椒ZaCCR 蛋白进行系统进化分
析，发现该蛋白与芸香科的甜澄(C^nw  蜜树(C "r (« 丨i )、克里曼丁結(C t 7n « cfc /neriuVia ) CCR 蛋白同源性较高，再次验证了本试验所克隆基因为 CCR 基因。花椒是中国栽培历史悠久的经济树种，是 重要的食用调料、中药材、香料、油料、工业原料等(宋 荣等，2014)。但由于花椒的枝和叶都密生皮刺，不仅
1.3竹叶花椒Z a C C J ?基因的转录模式分析
米集竹叶花椒(7祕/(.〇：«7/«/?1 o r m a i u m ,)嫁接树和 实生树的嫩梢，用液氮保存带回实验室，用植物总
R N A
提取试剂盒提取竹叶花椒嫁接树的茎、嫁接树
的叶、实生树的茎和实生树的叶的总R N A
并反转录
成c
D N A
。用特异引物T Z a C C R  F 和T Z a C C R  R 检测
在嫁接树叶、嫁接树茎、实生树叶和实生树茎中C C R  基因表达的具体情况(图3)，结果显示,ZflCC /?基因 在竹叶花椒嫁接树的莲中表 达量最高，其次是实生树的茎，再到嫁接树的叶，在 实生树的叶中表达量最小。2讨论
研宄显示C
C R
在木质素的生物合成途径中起
着不可或缺的作用，认为其可能调控木质素生物合 成途径中碳的流向(李波等,2006)。本研宄从转录组 角度设计C
C R
基因的特异性引物，通过基因测序成 功验证了所克隆基因为竹叶花椒C C R 基因，该基因 全长990 b p ，编码329个氨基酸。蛋白序列分析发现 只有氨基酸序列较为保守的活性位点上的少数特异 氨基酸残基能与底物结合并完成催化作用，并且发 现其保守结构域与其它C C R 蛋白的保守结构域高ZaCCR MTGSKKEAVCVi CsCCR MNGPEKEAVCvl CuCCR MNOPEKEWCvi CcCCR MNOPEKEWCvi PlCCR -MAKQKEAVCVf
FIG ■W W R T L L E N G Y S S IN A A I fP G T A S F.FSIPQ A T—N L N L FIG ■W W V R T L L E K G Y T O IH A A I F P O T A S F-F S L P G A T —K L N V FIG ■W W R T L L E K G V T K IH A A I 'P O T A S h -F S L P G A T --K L N V  90
FIG ■W W V R T L L E K G Y IK IH A A I 'P G T A S h L F S L P G A T --R L N V
a m IW L V R T L L D Q G Y T K IH A S V C S S iS .
L F E IP G A T D A S V S L ZaCCR CsCCR RVYE CuCCR CcCCR PtCCR EVFE
iA A I S R A I E G C N G V F H L A S P b J T L D D P K N P E K E L L  IP A V Q G T L N V L E A A R T F
IE A IS R A IE G C N G V F H L A S P K T L D D P R D P E R E L L IP A V Q G T L N V L E A A R R F  [E A IS R A IE G C K G V F H L A S P N T L D D P R D P E R E L L IP A V Q G T L N V L E A A R K F  [E A IS R A IE G C K G V F H L A S P N T L D D P R D P E K E L L IP A V Q G T L N V L E A A K R F  D A IC K A V E O C Q G V F H V A S P C T L E D P K D P Q E E L V M P A V Q G T L N V L E A A K R F
ZaCCR K V R R W L T S jlS A IV P N P S W P N G K V F D E T S W T D L D F C K S l
CsCCR G V R R W L T sIlS S IV P N P N W P Q G K V ID E T S V m D L D F C R S h  CuCCR G V R R W L T sIl S S IV P N P N W P Q G K V ID E T S W T D L D F C K S 1 CcCCR G V R R W L T sIl S S IV P N P N W P Q G K V ID E T S W T D L D F C K S I PtCCR
K V R R V W T S lI S A L V P N P S W P R E K V F D E S S W T D L D Y C K S F
1A E K A A W E F A E
L A E K A A W E F A E L A E K A A W E F A E L A E K A A W E F A E L A E K A A W E F A G
图
1 C C R
蛋白序列比对
注:Z a ：竹叶花椒;C s ：甜橙(登录号：X P  006470778.1); C u ：蜜柑
(登录号：G A Y 64224.1); C c ：克里曼丁結(登录号：X P _0240390-93.1) ; Pt：毛白杨(登录号：A K G 06587.1)Figure 1 A l i g n m e n t  o f  C C R  protein sequence Note: Za: Zanthoxylum
(innatum\ Cs: Citrus sin^mis  (Accession
No: X P  006470778.1); C u : Citrus unshiu  (Accession N o : G A Y 64224.1) ; Cc: Citrus clementina  (Accession N o : X P  024039093.1); Pt: Populus tomentosa  (Accession N o : A K G 06587.1)
024039093.1) 、蜜柑(C !：的.s  u 似/»:"，GAY 64224.1)的 CCR 蛋白聚为一类(图2)。
一麻风树(XPJM2078847.U
Jatropha curcas  (XP_012078847.1)
一木势(XP_021616798.1}
Maniho! esculenta  (XP 021616798.1)
—蓖麻(XP_002519377.1)
Ricinus communis  (XP 002519377.1) —毛果杨(XP_006385106.2)
Populus trichocarpa  (XP 006385106.2) —毛凸杨(AKG06587.1)
Populus tomentosa  (AKG06587.1)—月季(XP_024171437.1 >
Rosa chinensis  (XP 024171437.1)—狹长叶烟草(XP_019238546.1)
Nicotiana attenuata  (XP 019238546.1) —可可(XP_017979172.1>
Theobroma cacao  (XP 017979172.1) —暗影草(XP_021297182.)
Herrania umbralica  (XP 021297182.) —暗影草(XP_02129718U)
Herrania umbralica  (XP 021297181.1)
—ZaCCR
一甜橙(XP_006470778.1)
Citrus sinensis  (XP_006470778.1)
—克里曼丁桔(XP_024039093)
Citrus Clementina  (XP 024039093)—蜜柑(GAY64224.1)
Citrus unshiu  (GAY64224.1)
图2竹叶花椒Z a C C R
蛋白与其他植物C
C R
蛋白的系统进
化树
Figure 2 Phylogenetic tree o f  Z a C C R  protein o f  Zanthoxylum ar-
maium  a n d  C C R  protein o f  other plants
U0fss (u
jdx3
3>l «3
a:
5204 基因组学与应用生物学
造成果实采摘困难，还容易在采摘时破坏果实娇嫩
的疣状突起，导致果实品质下降(杨建雷等，2017, 经济林研宄，35(3): 30-34)。目前也没有一种很好的 化学或机械方法来代替手工采摘(原双进等，2006，西 北林学院学报，21(2): 84-86, 156)。因此，为解决采摘 难，采摘成本高等问题，选育无刺花椒品种成为解决 问题的重要途径。潘虎林和周桂珍(2
014，林业实用技 术，156(12): 44-46)利用多重嫁接的方法对花椒皮刺 及生长结果进行研宂，结果表明，花椒皮刺数量随嫁 接次数的增加而减少。
通过对Z n C C T?基因的转录模式分析可以看出，Z a C C f t基因在嫁接树的茎和叶中的表达量相对实生 树分别上调，由此推断嫁接可影响Z a C C R基因的表 达。C C R催化木质素中3种单体合成的还原反应，在植物木质代谢中也起到重要作用(L a c o m b e et al.，1997) 。影响C C R的活性会相应地影响木质素的生物 合成，进而影响植株木质素的含量(Piquemal et al.，1998) 。嫁接可能通过上调Z n C C f t基因的表达，从而 使竹叶花椒茎和叶的木质素的含量增加，使得皮刺 生长点过早木质化，进而影响皮刺的发育，导致嫁接 树皮刺减少。
本研究发现无论是嫁接树还是实生树，Z a C C R
基因在茎中的表达量都比在叶中高。经过对多种植 物的研究发现，C C R基因在植物的木质部及韧皮
部中的表达量要高于其他部位，在成熟茎中的表达 量最高(L a c o m b e et al., 1997; Lauvergeat et al.，2001; Li et al.，2005)，这与本研究所得结论相符。本研究成 功从竹叶花椒中克隆得到Z a C C f t基因，并发现Z a C-C K基因在嫁接树和实生树不同部位的差异表达，为 接下来对竹叶花椒木质素生物合成途径及代谢途径 进行深入研究和控制植物木质素含量相关研究提供 了理论依据。
3材料与方法
3.1材料
试验材料于云南省林业科学院树木园（102。44’42.57”E, 25。08'50.67">〇采集竹叶花椒嫁接树和
实生树嫩梢上的叶和茎，用液氮保存带回实验室，放在-80 °C冰箱中。
HiFi D N A聚合酶和反转录试剂盒订购于北京全 式金生物技术有限公司、R N A提取使用Q i a g e n的植 物总R N A提取试剂盒。3.2 R N A提取与c D N A合成
将竹叶花椒的实生树和嫁接树的各器官：叶、茎 放到液氮中研磨为粉末后，加入R N A提取液进行提 取，R N A质量检测使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳 完成，检测R N A浓度则使用N a n o D r o p™2000。选择 较完整，浓度适宜的R N A用反转录试剂盒合成c D-N A第一条链，并置于-20°C冰箱中保存备用。其余 的R N A置于-80°C冰箱中。
3.3 Z a C C Z?基因的克隆
米用巴拉圭瓜多竹(G u.a^u a/)aragrta)w m n)的C C R 基因为模板，本地B L A S T搜索竹叶花椒(Zant/ioxy-Z w m a r m a t u m)嫁接树和实生树嫩梢的转录组数据，得 到竹叶花椒的肉桂酰辅酶A还原酶基因(Z a C C/?)序 列，以该序列为依据，设计特异引物(Z a C C R I F:5’_A T G A C A G G G T C A A A A A A G G A-3，;Z a C C R1R5,-T T A A G G T T T A A G A T C A T G G G-3’)。用竹叶花椒嫁接树
和 实生树嫩梢的c D N A为模板，Z a C C R1F和Z a C-C R1R为引物，以H i n D N A聚合酶进行扩增得到 Z a C C f t全基因片段。经过电泳检测后将目的片段连 接到p U M T载体上，经P C R检测，送往生工基因进 行测序。
3.4 ZflCCT?基因蛋白序列分析
使用N C B I上的O R F l e n d e r分析获得竹叶花椒 肉桂酰辅酶A还原酶基因(Z a<X/〇的c D N A序列，得 到蛋白氨基酸序列，并用P r o P a r a m预测其蛋白的理 化性质；用SignalP4.1 server预测该蛋白有无信号 肽；通过N C B I对肉桂酰辅酶A还原酶基因的蛋白 氨基酸序列进行序列搜索，选择与Z a C C R蛋白序列 同源性较高的植物肉桂酰辅酶A还原酶蛋白序列，然后用M E G A7.0构建系统进化树。
3.5基因的转录模式分析
成功合成c D N A第一条链后，以T Z a C C R F(5’_C T G A T T C C T G C T G T C C A G G G-31)和 T Z a C C R R(5，_T A T C T T G T G T G A C T T G C A-3')作为特异弓I物，且以 Ubiquitins作为内参基因检测竹叶花椒Z a C C f i基因在嫁接树的茎、嫁接树的叶、实生树的茎和实生树的 叶中的具体表达情况。
作者贡献
王毅是本实验的设计和执行人；关淑文是完成
竹叶花椒肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与表达分析5205
数据分析，撰写论文初稿；原晓龙和郝佳波是参与实 验设计及试验结果的分析；王毅和陆斌是项目的构 思者及负责人，指导实验设计、分析数据、修改论文。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由云南省科技厅重点研发项目P018B B-008)资助。
参考文献
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