Nature综述：寡核苷酸疗法，未来可期
寡核苷酸疗法寡核苷酸通常是由20个以内短链核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）组成，可以通过Watson-Crick碱基互补配对原理与DNA、mRNA或者pre-mRNA配对⽽实现⾮常⾼的选择性，精准地抑制某些基因，让编码异常的基因保持「沉默」，从⽽阻⽌许多「错误」的蛋⽩质表达。
虽然⼤多数的寡核苷酸疗法都专注于基因沉默，但是其他包括剪接调节和基因激活等策略也正在推进中，这将可能的靶点范围扩⼤到常规药物的范围之外。
⽬前在研的寡核苷酸药物种类很多，包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、⼩⼲扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）、微⼩核糖核酸（microRNA，miRNA）、核酸适配体（aptamer）等。
截⾄2020年1⽉，10种寡核苷酸药物已获FDA批准（表1；图1）。然⽽，阻碍寡核苷酸疗法⼴泛应⽤的⼀个主要障碍是难以有效地将其输送到肝脏以外的靶器官和组织。此外，还必须仔细考虑脱靶⼲扰、序列和化学依赖性毒性等。
表1. FDA批准的寡核苷酸疗法
纳⽶颗粒制剂上。最近开发的⽅法，如内源性囊泡（即外泌体）装载、球型核酸、纳⽶技术应⽤（如DNA笼）和「智能」材料等也在不断推进中。
8⽉11⽇，⽜津⼤学和⿇省理⼯学院的科学家们在Nature reviews drug discovery上发表了⼀篇综述，重点介绍了寡核苷酸药物递送改进⽅⾯的最新进展。以下为摘编内容。
递送挑战
将寡核苷酸疗法有效递送到多种组织中仍然是⼀个主要的挑战。寡核苷酸通常是⼤的亲⽔性多聚阴离⼦（单链ASO约为4–10 kDa，双链siRNA约为14 kDa），这种特性意味着它们不容易通过质膜。
在活性⽅⾯，系统注射的核酸药物必须抵抗细胞外间隙的核酸酶降解，绕过肾脏清除，穿过⽑细⾎管内⽪，通过细胞旁或跨细胞通路到达器官/组织内的靶细胞，并穿过质膜，在溶酶体降解或通过胞吐被重新排出之前逃离内溶酶体系统，到达正确的细胞内作⽤部位。
通过系统递送到达中枢神经系统（CNS）是⼀个额外的障碍，因为基于寡核苷酸的疗法通常不能穿过⾎脑屏障。不过，经腰椎穿刺直接注⼊脑脊液的寡核苷酸（如nusinersen）已被证明可使分⼦在中枢神经系统得到良好的分布。
到⽬前为⽌，⼤多数寡核苷酸疗法（以及⼏乎所有已获批的核酸药物）都集中在局部给药（例如，眼睛或脊髓）或对肝脏的递送。眼睛是⼀个免疫特权器官，这使得它⼀直是基因和寡核苷酸疗法（例如，pegaptanib和fomivirsen）选择的解剖学靶组织。肝脏具有不连续的肝窦内⽪，这意味着在肾脏清除前能迅速摄取游离寡核苷酸和更⼤的纳⽶粒。肝脏还含有⾼浓度的受体（例如，清道夫受体和去唾液酸糖蛋⽩受体），这些受体可促进摄取和/或迅速再循环。尽管其他具有不连续或有窗孔内⽪的⾼度⾎管化组织，如肾脏和脾脏，也是寡核苷酸积累的场所，但开发有效的肝外系统输送技术仍
不连续或有窗孔内⽪的⾼度⾎管化组织，如肾脏和脾脏，也是寡核苷酸积累的场所，但开发有效的肝
外系统输送技术仍是寡核苷酸领域的主要⽬标。
改进递送的⽅法化学修饰
化学修饰是增强寡核苷酸药物递送的最有效途径之⼀。核酸主链、核糖的糖部分和核碱基的修饰已被⼴泛应⽤，以改善寡核苷酸药物的类药性，从⽽提⾼药物的递送能⼒（图2）。
具体来说，修饰被⽤来改善寡核苷酸的药代动⼒学、药效学和⽣物分布。某些⽅式的功能也需要特定的修饰模式（例如gapmers）。第⼆代gapmer ASO的⼤量化学修饰⾜以使其输送到各种组织，⽽⽆需额外的递送剂。
此外，在迄今批准的10种寡核苷酸疗法中（表1），有8种是「裸的」（即缺乏额外的运载⼯具），仅依靠化学修饰来促进其组织递送。⽬前由Ionis Pharmaceuticals开发的gapmer ASO，包括肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、中央核性肌病，尤其是亨廷顿病的药物也是如此（表2）。这些结果证明了化学修饰的重要性。
表2. 正在开发中的精选寡核苷酸疗法
⽣物偶联技术
ASO和siRNA的递送潜⼒可以通过直接共价结合可促进胞内吸收的不同「元件」来增强，以将药物靶向特定的细胞/组织或减少循环中的药物清除。这些「元件」包括脂质（例如，促进与循环中脂蛋⽩颗粒相互作⽤的胆固醇）、肽（⽤于细胞靶向和/或细胞穿透）、适体、抗体和糖（如N-⼄酰半乳糖胺，GalNAc）。
a)脂质-siRNA结合物，其中胆固醇与passenger链的3ʹ末端结合。这种⽅法已被⽤于肝脏基因沉默（例如ApolipoproteinB, Apob）。
b)Triantennary GalNAc与ASO共轭。GalNAc缀合物可使⼩⿏肝脏特异性ASO的效⼒提⾼约7倍，在患者中提⾼约30倍。因此，由于GalNAc结合物具有很⾼的肝脏沉默潜⼒，以及相较于纳⽶复合物的⼩尺⼨、明确的化学组成和较低的合成成本，是⽬前正在开发中的实验性寡核苷酸药物的主要策略之⼀。其在⼏家制药公司的药物开发管线中占有重要地位，最显著的当属Alnylam，他们正在开发⾎友病A和B以及原发性⾼草酸尿1型的药物。此外，由Alnylam开发的GalNAc缀合siRNA——givosiran于2019年11⽉获得FDA批准。inclisran是第⼆种GalNAc缀合的siRNA（由
Alnylam/The Medicines Company开发并被Novartis收购），正在进⾏家族性⾼胆固醇⾎症的后期临床试验。许多其他制药公司，如Dicerna Pharmaceuticals、Silence Therapeutics、Arbutus Biopharma 和Arrowhead Pharmaceuticals也在开发GalNAc缀合寡核苷酸产品。
c)抗体-siRNA结合物。寡核苷酸可以通过点击化学或巯基-马来酰亚胺键连接到抗体或Fab⽚段上。
d)适体-siRNA结合物。适体可以被认为是「化学抗体」，它以⾼亲和⼒与各⾃的靶蛋⽩结合，但由于其制造简单且成本低廉（即通过化学合成），体积较⼩，免疫原性较低，因此与抗体相⽐具有许多优势。
e)肽-ASO结合物。这个例⼦是与细胞穿透肽（Pip–9b2）结合的PMO（⼆酰胺吗啉代寡核苷酸）。肽可以赋予性寡核苷酸结合物组织/细胞靶向性、细胞穿透性或内体裂解特性。⽣物结合物构成明确
的同种单组分的分⼦实体，具有精确的化学计量，这意味着⼤规模合成相对简单，并且它们的药代动⼒学特性明确。此外，相对于纳⽶颗粒⽅法（下⽂讨论），⽣物结合物往往是⼩型的，这意味着它们通常表现出良好的⽣物分布特征，因为能够到达那些具有不连续或有窗孔内⽪组织之外的组织中。
寡核苷酸⽣物结合⽅法的共同主旨是促进结合物与其相应的细胞表⾯受体蛋⽩之间的相互作⽤，导致随后通过受体介导的内吞作⽤内化，将药物靶向递送到特定组织或组织内的特定类型细胞。
纳⽶载体技术
纳⽶技术和材料科学的发展为解决寡核苷酸药物递送的挑战提供了优势和潜在的解决⽅案，尤其是针对跨越⽣物屏障和跨膜细胞内递送的要求。纳⽶颗粒给药系统的主要优点包括对纳⽶颗粒的⽣物物理学（例如，尺⼨、形状和化学/材料成分）和⽣物学特性（例如，靶向配体功能化）进⾏定制优化，从⽽实现⾼度定制的递送平台。
⽤于核酸药物递送的多种纳⽶载体正处于不同的发展阶段，包括与阳离⼦聚合物（例如，聚⼄烯亚胺）、树枝状⼤分⼦、细胞穿透肽（如MPG-8、PepFect6、RVG-9R和Xentry-KALA），以及⽆机⽅法（例如，磷酸钙纳⽶颗粒）⾮共价络合。下⾯将重点介绍⽤于寡核苷酸递送的基于脂质的制剂，以及包括内源性外泌体、球型核酸和⾃组装DNA纳⽶结构等的新兴⽅法。
f)脂质纳⽶颗粒包裹siRNA。
g)结合脑靶向狂⽝病病毒糖蛋⽩肽的⼯程外泌体。外泌体由含有来⾃供体细胞的脂质和蛋⽩质的膜组成。外泌体还含有性物质（如siRNA）和来⾃供体细胞的蛋⽩质及核酸（如microRNA）。
h)球型核酸纳⽶颗粒。由⾦属-巯基键连接的ASO紧密覆盖的⾦核组成。
i)⾃组装DNA笼四⾯体纳⽶结构。寡核苷酸疗法（例如siRNA和ASO）可以被纳⼊DNA笼中。
基于脂质的制剂
脂质制剂是增强核酸递送的最常见⽅法之⼀。例如，⼀些脂质纳⽶颗粒（LNP，也被称为稳定的核酸脂质颗粒）是含有可电离脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚⼄⼆醇-脂质结合物的脂质体，已成功地⽤于多种疾病。具有⾥程碑意义的例⼦是近两年patisiran的批准。
LNP的⼀个缺点是它们的递送主要局限于肝脏和⽹状内⽪系统，因为该组织中的窦状⽑细⾎管上⽪提供⾜够⼤的空间，允许这些相对较⼤的纳⽶颗粒进⼊。不过⼤尺⼨的纳⽶颗粒也有益处，因为它基本上排除了肾脏过滤，并允许输送更⾼的有效载荷。
LNP可通过肽、聚⼄⼆醇或其他具有细胞特异性靶向的配体【例如，GalNAc（肝细胞）、anisamide（肺肿瘤）、strophanthidin（各种肿瘤）和维⽣素A（肝星状细胞）】进⼀步功能化。值得注意的是，LNP复杂性的增加使其制造复杂化，并可能增加其毒性，这是⼀个可能限制其临床应⽤的主要问
题。例如，LNP siRNA颗粒（如patisiran）需要预先⽤类固醇和抗组胺药物来消除不必要的免疫反应。
外泌体
外泌体是⼀种异质性脂质双层囊泡，直径约为100nm。外泌体被细胞释放到细胞外空间，并通过转移复杂的⼤分⼦货物（即核酸、蛋⽩质和脂类）促进细胞间的通讯。
在寡核苷酸药物递送⽅⾯，外泌体具有许多优点：1）能够穿过⽣物膜，如⾎脑屏障；2）⽆毒，已被安全应⽤于移植物抗宿主病患者；3）有可能以⾃体⽅式产⽣；4）某些来源的外泌体已被证明具有固有的促再⽣和抗炎特性，可增强寡核苷酸效果；5）⼯程化的外泌体可以作为⼀个模块化的平台，借此可以部署和/或靶向「元件」的组合。
⼤规模⽣产性外泌体（包括临床级）的⽅法已被报道。利⽤具有永⽣潜⼒的间充质⼲细胞系在⽣物反应器中进⾏培养，可以产⽣⼤量含有外泌体的条件培养基。随后利⽤尺⼨排阻液相⾊谱等⽅法将性外泌体从上清液中分离出来。⽬前Codiak Biosciences 和Evox Therapeutics这两个公司的⼯程外泌体技术的应⽤正处于后期临床前阶段。
球型核酸
球型核酸颗粒由亲⽔性寡核苷酸（例如ASO、siRNA和免疫刺激性寡核苷酸）覆盖的疏⽔性核⼼纳⽶颗粒（包括⾦、⼆氧化硅或各种其他材料）组成，这些寡核苷酸通过巯基键紧密地堆积在核⼼纳⽶颗粒表⾯（图4h）。与其他纳⽶颗粒设计不同，球型核酸颗粒中的寡核苷酸从核⼼结构向外辐射。尽管暴露在外，由于空间位阻、局部⾼盐浓度以及通过与蛋⽩冠的相互作⽤，寡核苷酸在⼀定程度上不受溶核降解的影响。⽬前，Exicure公司正在将球型核酸颗粒商业化，应⽤于寡核苷酸递送。
DNA纳⽶结构
DNA纳⽶结构有很多种，也被⽤于寡核苷酸的递送。这些结构包括DNA折纸术，即长DNA分⼦通过短DNA「订书钉」固定在特定的结构中，从⽽形成各种各样的复杂形状，包括多边形纳⽶结构，如DNA笼。DNA纳⽶结构的物理特性（例如，尺⼨、柔韧性和形状）可以微调，以最⼤限度地发挥其递送潜⼒。
此外，DNA纳⽶结构的⼀个⾮常有趣的特性是它们不会在肝脏中积聚，并且可以被设计成⼩尺⼨（约20 nm），这意味着它们可以进⾏肝外递送。然⽽，进⼀步缩⼩DNA纳⽶结构的尺⼨⽽不进⾏额外的功能优化可能会导致肾脏滤过功能增强，整体⽣物利⽤度降低。
刺激-响应纳⽶技术
刺激敏感、可激活的药物递送纳⽶技术正在成为寡核苷酸递送⽅案。例如，⼀种由PBAVE⽀架聚合物组成的siRNA动态多聚共轭物，通过酸不稳定的连接物连接到PEG和N-⼄酰葡糖胺（肝靶向）部分，在静脉给药后诱导⼩⿏肝细胞中诱导有效的基因沉默。具体来说，内体的酸性环境诱导PEG和N-⼄酰葡糖胺基团断裂，导致PBAVE叔胺暴露，缓冲luminal pH值，使内体逃逸。
生活中最常见纳米技术甚⾄更复杂的「智能」递送⼯具也可以通过DNA纳⽶技术实现。例如，DNA折纸术已经被⽤来产⽣⼀个盒⼦，这个盒⼦被打开并结合两个结构变化的适体「锁」。当两个适体与它们的⽬标蛋⽩相互作⽤时，锁打开，DNA盒改变构象释放其内容物。这项技术被⽤于递送⾦纳⽶颗粒和抗体⽚段，但也可能被调整⽤于核酸递送。这种逻辑门控递送⼯具具有许多优点，因为性有效载荷可以集中在所需的作⽤部位，从⽽提⾼疗效并减少脱靶效应。
思考和展望
建⽴能够将寡核苷酸药物递送到特定器官或组织的平台可能涉及明确的化学修饰模式、可预测药代动⼒学和药效学特性的偶联/络合策略，以及清楚的作⽤机制。借此，寡核苷酸疗法有潜⼒扩⼤可能的药物靶点范围，并提供使新药能够迅速开发，以满⾜尚未实现和正在出现的临床需求的⽅法。
此外，尽管LNP和GalNAc结合物在临床前和临床研究中提供了良好的肝脏递送，但肝脏以外的系统性递送仍需要进⼀步的研究、创新和发展。在许多情况下，经批准的寡核苷酸药物很可能极其昂贵，令
⼈望⽽却步。例如，nusinersen第⼀年的费⽤为75万美元，随后⼏年的费⽤为37.5万美元。eteplirsen每年的费⽤为30万美元。
像nusinersen这样的⾼效、改变⽣活的药物性价⽐值得⽀持。相⽐之下，疗效有限的etplersen的性价⽐则没有说服⼒。随着寡核苷酸疗法与新型给药⽅式的进⼀步结合，这些进展可能会增加材料成本。然⽽，新型给药技术提供了更⾼的疗效和/或更好的靶向性意味着给药剂量可以降低，这可能反过来降低成本。
另⼀个关键的考虑因素是安全性。虽然⼈们对标准核酸修饰化学制剂的免疫刺激特性已经有了较为深⼊的了解，但递送剂成分或配体结合物的潜在免疫原性可能对安全有效的寡核苷酸药物递送提出额外的挑战。考虑到⼤量的核酸化学、递送技术和⽅式，在许多情况下不太可能进⾏直接的头对头⽐较。⼈⼯智能和计算机建模的应⽤可能是解决这些问题的⼀种⽅法。
最近，许多备受瞩⽬的监管机构的批准表明，寡核苷酸药物递送已经成熟到可作为多种不同适应症的临床应⽤。核酸化学修饰、与细胞/组织靶向配体的结合以及纳⽶颗粒载体系统的⾼度优化组合提⾼了寡核苷酸药物递送的效率，并/或使分⼦能够到达先前⽆法企及的靶组织。这些进展为许多罕见或⽬前⽆法的疾病提供了新的希望。
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