青蒿素生物合成
          10生物技术（2）班 曾庆辉 201024112211
    青蒿素是我国科研人员从传统中医药黄花蒿中提取出来并自主研发的一种抗疟疾特效药[1]。20世纪70年代，我国科技工作者从黄花蒿中分离提纯出一种抗疟活性单体——青蒿素，以后又确定了它的分子结构和构型。1986年我国自主研发的蒿甲醚油针剂、青蒿琥酯钠盐的水针剂以及青蒿素栓剂等抗疟疾药作为一类新药在我国批准生产。1995年蒿甲醚率先被收入国际药典，这是我国首次得到国际认可的自主研发新药。目前，青蒿素系列抗疟药已有5种新药(青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、复方蒿甲醚)共9种剂型上市并在世界各国销售，每年挽救了数百万重症疟疾患者的生命。除了独特的抗疟作用外，青蒿素系列药物还具有抗血吸虫、肺吸虫、红斑狼疮、皮炎以及免疫调节，抗流感等多种疗效[2]。但是，目前国际抗疟药市场上青蒿素类药物只占有很少的份额，其原因主要在于青蒿素原料缺乏。由此，有研究者另辟蹊径，设想通过生物合成青蒿素。时至今日，青蒿素的生物合成已经取得一定进展，介绍如下：
早在20世纪80年代，中国科学院上海有机化学研究所汪猷院士领导的研究小组就利用放射性同位素标记的2-14C-青蒿酸与青蒿匀浆(无细胞系统)保温法证明，青蒿酸和青蒿B 是青蒿素的共同前体[3]。青蒿素生物合成途径仅见于青蒿，但其“上游”途径为真核生物所共有，可望通过“下游”途径重建，在真核微生物(如酵母)中全合成青蒿素。过去10年来，青蒿素合成基因被国内外研究团队陆续克隆并导入酿酒酵母细胞，已成功合成青蒿酸及双氢青蒿酸等青蒿素前体。由于酵母缺乏适宜的细胞环境，尚不能将青蒿素前体转变成青蒿素。因此，青蒿依然是青蒿素的唯一来源，凸显出继续开展青蒿种质遗传改良的必要性。同时，青蒿素生物合成的限速步骤尤其是终端反应机制已基本得到阐明，有助于开展青蒿素形成与积累的环境模拟及仿生，从而为彻底缓解青蒿素的供求矛盾创造先机[4]。若以双氢青蒿酸为青蒿素的直接前体，则青蒿素生物合成过程如下：首先是从乙酰辅酶A经异戊烯基焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、法呢基焦磷酸到紫穗槐-4,11-二烯的合成途径，其中DMAPP与IPP受IPP异构酶(IPPI)催化发生互变，二者再被法呢基焦磷酸合成酶(FDS)作用生成法呢基焦磷酸，并在紫穗槐二烯合酶(ADS)催化下闭环产生紫穗槐-4,11-二烯；其次是从紫穗槐-4,11-二烯到双氢青蒿酸的合成途径，紫穗槐-4,11-二烯在细胞素P450单加氧酶(CYP71AV1)催化下，经连续氧化依次生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，其中青蒿醛受青
蒿醛双键还原酶2(DBR2)催化而还原成双氢青蒿醛，后者再在青蒿醛脱氢酶1(ALDH1)催化下氧化成双氢青蒿酸。双氢青蒿醇转变成双氢青蒿醛由ALDH1/CYP71AV1催化，其逆反应则由双氢青蒿酸还原酶1(RED1)催化，最后是从双氢青蒿酸到青蒿素的合成途径，双氢青蒿酸经过未知的多个非酶促反应最终生成青蒿素。此外，青蒿酸可能经多步反应合成青蒿素B后再转变成青蒿素[5]。
青蒿素的生物合成主要任务有：①青蒿素前体合成工程菌的构建。在这里为了便于叙述，将上述青蒿素生物合成过程分为“上游”、“中游”和“下游”三个途径，分别是从乙酰辅酶A到法呢基焦磷酸的“上游”途径、从法呢基焦磷酸到双氢青蒿酸的“中游”途径和从双氢青蒿酸到青蒿素的“下游”途径。青蒿及其他高等植物与酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反应完全相同(循甲羟戊酸途径)，因而只需在酵母中额外增加一个青蒿素合成代谢支路，就能让酵母全合成青蒿素。目前，中游途径的酶促反应已通过导入青蒿ADS，CYP71AV1，CPR，DBR2和ALDH1等基因至酵母而得以完全重建，但下游途径的反应条件在酵母中则尚未建立。回溯到2003年，美国Keasling小组将青蒿ADS基因经密码子优化后导入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替大肠杆菌萜类合成途径，首次在细菌体内合成出青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐-4,11-二烯，在6L发酵罐中培养60 h的产率达到450 m
g/L[6]。2006年，他们将ADS基因连同CYP71AV1和CPR基因同时导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青蒿酸的酵母工程菌，经代谢途径修饰与优化，其产率已达153 mg/L[7]。加拿大Covello小组于2008年将新克隆的青蒿DBR2基因连同ADS，CYP71AV1和CPR基因一同导入酿酒酵母，率先培育出合成双氢青蒿酸的酵母工程菌，其中双氢青蒿酸产率为15.7 mg/L，青蒿酸产率11.8 mg/L[8]。中国医学科学院及北京协和医科大学药物研究所的程克棣小组将青蒿 ADS 基因按酵母偏爱密码子优化并导入酿酒酵母后，也培育出产紫穗槐-4,11-二烯的酵母工程菌[9]。瑞典卡尔马大学的Brodelius小组将ADS基因导入酵母中，分别获得质粒表达及染体整合表达的产紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌，其中质粒表达酵母工程菌培养16d后的紫穗槐-4,11-二烯，产量为0.6 mg/L[10]。
然而，到目前为止，国内外还没有一个研究小组将酵母工程菌中的青蒿素前体转变成青蒿素，其原因可能是酵母不具备青蒿素合成所需要的细胞环境。这里面临着一个策略选择，即在微生物中合成青蒿素前体后是改用化学方法半合成青蒿素，还是继续探索让微生物将青蒿素前体转变成青蒿素的方法？现在看来, 国外选择的是前者，并且已先期启动产业化进程。不过，从工艺、成本、环境影响等方面考虑，实现青蒿素的微生物全合成无疑有着更大的应用价值。
②高产青蒿素转基因青蒿植株的培育。这一步骤首先要寻高产青蒿素转基因青蒿培育的有效途径。青蒿素是一种次生代谢产物，它在青蒿中的积累量很小，而且不同地区生态类型的差异很大。中国科学院植物研究所叶和春研究小组最早开展转基因青蒿研究，他们将重组法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)导入青蒿，以增加 FPS 基因的拷贝数目，期望增大青蒿素生物合成途径的碳流(“开源法”)，由此获得青蒿素含量比对照高3~4倍的转基因青蒿发根(0.2%~0.3%)[11]及比对照高2~3倍的转基因青蒿植株(0.8%~1%)[12][13]。类似地，印度科学家用重组羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶基因(HMGR)培育转基因青蒿植株, 其青蒿素含量提高22.5%将反义鲨烯合酶基因(asSS)导入青蒿，以阻断竞争青蒿素生物合成的类固醇分支途径(“节流法”)，获得类固醇含量比对照(0.08%鲜重)下降近一半(0.04%~0.05%鲜重)及青蒿素含量比对照(0.45%干重)提高近3倍(1.23%干重)的转基因青蒿植株[14]。上海交通大学唐克轩小组利用发夹RNA介导的RNA干扰技术阻断类固醇合成途径，使转基因青蒿中的青蒿素含量达到3.14%干重，比对照提高3.14倍[15]。最近, 中国科学院植物研究所的研究小组利用β-石竹烯合酶 cDNA 反义片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，通过减少β-石竹烯对紫穗槐-4,11-二烯的竞争,使青蒿素含量提高50%以上[16]。在今后的研究中，可以考虑将“开源”与“节流”两种方法结合起来，也许能收到更好的效果。一种更有前景的创意是将青
蒿中更多的非青蒿素合成途径剔除或者仅保留青蒿素合成途径及其他必要的代谢途径，从而通过合成生物学创造出自然界不存在的新型代谢网络。
③通过调节激素及发育基因表达促进青蒿素合成。细胞分裂素可刺激叶片生长，而青蒿素主要由青蒿叶片合成。因此，提高青蒿中的细胞分裂素水平有可能促进青蒿素的合成。叶和春小组曾将异戊烯基转移酶基因(ipt)导入青蒿，结果使细胞分裂素水平提高2~3倍，青蒿素含量增加30%~70%。
④利用异种植物创建青蒿素生物合成新支路。美国肯塔基大学的Chapel小组将青蒿ADS基因及鸟类FPS基因导入烟草中表达，经叶绿体信号序列引导，ADS 和 FPS 被转运至叶绿体，并合成紫穗槐-4,11-二烯，产量达到25μg/g鲜重，如果将来能将青蒿素合成途径“搬到”叶绿体内，那么这种独特的“叶绿体催化”方法可能比常规的“细胞质催化”方法更能获得高产青蒿素。荷兰Bouwmeester小组利用烟草表达青蒿ADS，FPS和HMGR基因，获得产紫穗槐-4,11-二烯的转基因烟草。但是，当继续导入CYP71AV1基因后，却未检测到预期产物青蒿酸，而只检测到青蒿酸-12-β-双葡萄糖苷，产量达到39.5 mg/kg鲜重，推测其为烟草葡萄糖基转移酶的催化产物。
加拿大Covello小组将青蒿ADS和CYP71AV1基因导入烟草后，只检出紫穗槐-4,11-二烯和青蒿醇，未检出青蒿酸。若再导入DBR2和ALDH1基因，也只检出双氢青蒿醇，未检出双氢青蒿酸。由此可见，尽管在青蒿以外的植物中重建青蒿素合成途径是可行的，但在产物(如青蒿酸糖苷)的后处理上可能会面临较多的技术困难。
在青蒿素的生物合成过程还有几个关键问题需要注意：①青蒿素合成基因表达具有时空特异性，利用实时荧光定量PCR技术追踪分析了青蒿素合成基因的发育及组织表达模式，结果显示，各基因的表达水平在8月份开花前达到高峰，其中青蒿素特异合成ADS mRNA和CYP71AV1 mRNA升幅最大，为最低水平的12和15倍。处于盛花期的青蒿在根、茎、叶、花各个组织中都能检测到青蒿素合成基因的表达，叶片中ADS mRNA水平较其他组织高2倍左右。我们采用组织化学染法和分光光度法对CYP71AV1启动子-GUS融合基因转化烟草在正常和胁迫条件下的表达进行定性及定量检测，结果表明：在脱水、4℃和紫外辐射条件下，转基因烟草的GUS活性提高1.4~2.7倍。瑞典及荷兰科学家的研究结果表明，ADS，CYP71AV1，DBR2和ALDH1等青蒿素合成基因在花芽及嫩叶中的表达水平比其他组织(老叶、茎、根、发根培养细胞)高40~500倍，而对青蒿素合成有负调节作用的双氢青蒿醛还原酶基因(RED1)则只在发根培养细胞中高表达。
②内外环境因素促进青蒿素的合成与积累。早在2000年，叶和春小组就证明，植物病原真菌可以不同程度地促进体外培养青蒿发根中青蒿素的积累，其中大丽花轮枝孢处理发根后的青蒿素含量比对照提高45%[17]南京大学谭仁祥小组也证实，来自真菌的寡聚糖激发子可使青蒿素含量从7 mg/g干重提高到13 mg/g干重，而寡聚糖激发子与一氧化氮供体硝普钠共用，则青蒿素含量升高至12~22mg/g干重。叶和春小组还发现，外源性赤霉酸可以通过反馈抑制赤霉酸合成，将碳源分流到青蒿素合成途径,导致青蒿素含量增高，同时青蒿酸含量降低，表明从青蒿酸到青蒿素是青蒿素合成的限速步骤之一。
③青蒿素产量与单线态氧水平高度相关。以往研究表明，青蒿收获后干燥及重金属(铅)、盐胁迫处理青蒿均有利于青蒿素的积累，推测极端环境胁迫尤其是氧化胁迫可能与青蒿素合成有着十分密切的关系，但始终缺乏活性氧参与青蒿素生物合成的证据。我们研究发现，转基因青蒿植株经过冷处理后,单线态氧的释放比对照植株明显增强, 同时青蒿素含量从1.23%增加到1.66%，转基因青蒿植株干粉经15个月贮存后青蒿素含量升至2.35%。我们采用mRNA 定量扩增技术系统地研究了低温[18]、衰老、水杨酸及茉莉酸甲酯等内外环境因素对青蒿素生物合的影响，结果发现青蒿素合成mRNA水平升高、酶类合成增加、青蒿素
含量提高均与单线态氧大量释放同步发生，从而为单线态氧参与调节青蒿素生物合成提供了直接证据。
④单线态氧来自青蒿叶绿体并可诱导青蒿素合成基因表达。拟南芥的条件性 flu 突变体在由黑暗转光照的交替中可激发叶绿体产生单线态氧并且由核基因组编码的叶绿体蛋白Executer 1和Executer 2负责单线态氧信号从叶绿体向细胞核的逆向转导。最近，我们还发现，Executer 1基因与抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶)基因均受萜类合制剂处理后激发的单线态氧的共调控(未发表结果).关于内源性与外源性单线态氧在青蒿素合成中的作用，我们利用类胡萝卜素合成抑制剂证明，叶绿体释放的单线态氧可作为“逆向信号转导分子”诱导核内编码的青蒿素合成相关基因表达。相反，我们在培养基中添加单线态氧光敏发生剂孟加拉玫红(rose Bengal)疟疾的青蒿素是用什么提炼的并照光或通入次氯酸钠与过氧化氢反应产生单线态氧后，不仅显著降低青蒿素含量，而且导致大量未知产物合成[19]。以上结果表明，单线态氧催化的非酶促反应可能是青蒿素生物合成的限速步骤，而单线态氧来源于细胞内而不是细胞外，内源性单线态氧不仅能上调青蒿素合成基因表达，而且可催化双氢青蒿酸转变成青蒿素。