摘要
利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆青蒿索生成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对青蒿素生物合成的调控规律，是打破青蒿素生物合成的限速步骤，大幅度提高青蓠素含量，最终达到利用植物生物技术工业化生产青蒿素的目的必须解决的关键阀题。本论文基于此目的，开展了青蒿素生物合成相关基因的分子克隆工作。
用ＲＡＣＥ方法从青蒿高产株系００１中克隆了一个新的１８８６ｂｐ的全长倍半萜合酶ｅＤＮＡ。晓隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为３９％，３８％和４１％；与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆ｃＡＳＣｌ２５的一致性为５０％，４８％和５９％。ｃＤＮＡ编码区序列被克隆进原核表达载体ｐＥＴ一３０ａ，并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达，但过量表达的蛋自主要是以不溶性蛋白形式存在。ＲＴ－ＰＣＲ分析表明此基因在茎、叶和花中表达，在根中没有表达。＼用ＲＴ／ＰＣＲ方法从青蒿高产株系００１中克隆了ａｍｏｒｐｈａ－４，１１－ｄｉｅｎｅ合酶ｅＤＮＡ。ｉ将该ｅＤＮＡ插入原核表达载体ｐＥＴ３ｄ并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中过量表达。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＡＭＳ基因在青蒿基因组中至少有３个拷贝。ＡＭＳ基因组ＤＮＡ有一个复杂的结构，包含有７个外显子和６个内含子。ＲＴ／ＰＣＲ分析表明ＡＭＳ基因在叶片、茎和花中表达，而在根中没有表达。
疟疾的青蒿素是用什么提炼的用ＲＡＣＥ方法首次从青蒿中克隆了一个１５３９ｂｐ全长鲨烯合酶ｅＤＮＡ。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为７０％、７７％、４４％、３９％。青蒿鲨烯合酶基因组ＤＮＡ有一个复杂的结构，包括１４个外显子和１３个内含子。全长的或Ｃ末端截短的鲨烯合酶ｃＤＮＡ被克隆进原核表达载体ｐＥＴ３０ａ并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶ｅＤＮＡ的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达，而Ｃ末端截短３０个疏水氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。｛
关键词：童：重量豢，譬麴盒感樽羞基因、分子克隆、大肠杆菌过量毒达、分子分艇
Ａｂｓｔｒａｅｔ
ＬｉｕＹａｈ（Ｂｏｔａｎｙ）
ＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆｅｓｓｏｒＹｅＨｅｃｈｕｎａｎｄＰｒｏｆｅｓｓｏｒＬｉＧｕｏｆｅｎｇＩｎｏｒｄｅｒｔｏｂｒｅａｋｄｏｗｎｔｈｅｒａｔｅ—ｌｉｍｉｔｅｄｓｔｅｐｓｉｎｔｈｅａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅａｌｉｚｅｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，ｒｅｌａｔｅｄｋｅｙｇｅｎｅｓｉｎａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍｕｓｔｂｅｃｌｏｎｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐａ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｃｏｌｉｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａ
ｌｙｓｉｓ
塑＝曼童苎茎生塑鱼堕墨茎塑丝堕苎丝星——一——
第一章青蒿素生物合成及其调控研究进展
青蒿素（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）是我国学者在７０年代初从中药青蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｆａａ册蛔Ｌ．）中分离得到的抗疟有效单体，是含有过氧基团的新型倍半萜内酯化合物“３，分子式为ｃ．。Ｈ：２０５（图１）。青蒿素是与已知抗疟药作用方式完全不同的新型抗疟药，具有高效、速效、低毒的特点，青蓠素的发现被认为是抗疟药研究史上的一个突破。青蒿素是唯一由我国科学家自主研究开发并在国际上注册的药物乜１．青蒿素的发现受到世界卫生组织的高度重视，被认为是目前世界上最有效的脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，近年来还发现青蒿素具有免疫抑制和抗艾滋病病毒等作用。青蒿素在国际市场上供不应求，据统计全球在未来５一ｌＯ年中对青蒿素的需求量将达到１５０吨，而目前的产量还不到１０吨，供求矛盾仍十分突出。全球每年３—５亿人的市场规模中，青蒿素类产品的市场占有率尚不足１％。成本过高，疫区患者负担不起是主要原因。如果通过研究达到降低成本的目的，则在未来３—５年内青蒿素类产品有望占有世界市场的２０一３０％，总体市场价值达到卜２亿美元。据世界卫生组织最新报告，疟疾是除艾滋病以外世界上有明显上升趋势的疾病，其危害是使患者长时间丧失劳动能力，甚至危及生命。全球疟疾主要分布在撒哈拉以南的非洲、南亚
、东南亚、南美及南太平洋地区，全球受到疟原虫威胁的人口达到２０亿，同时，疟原虫对氯喹等传统抗疟药的抗性正在各个疟疾流行区迅速蔓延。每年疟疾临床病例达到５亿人次，每年死亡病例为３００万左右。疟疾作为流行最广、历史最长、危害最大的人类寄生虫传染病，一直是第三世界国家发病率和死亡率最高的病种之一。近来国际社会越来越多地开始关注疟疾控制问题。无论是ＷＨＯ新任总干事长呼吁的“遏止疟疾”，还是英国首相代表Ｇ８领导人作出的积极反应；无论是美国学者呼吁美国总统增加疟疾研究的预算，还是日本首相的“全球寄生虫控制”行动方案；无论是非洲领导人发表的第３４届非统组织首脑会议哈拉雷“疟疾宣言”，还是印度政府公布的耗资２亿美元的“疟疾控制计划”。所有这些都表明疟疾给人类，特别是给发展中国家人民带来的深重灾难已引起各方面的重视。中国作为世界上越来越有影响的发展中国家，我们在疟疾大规模防治和以青蒿素及其衍生物研究成功为代表的抗疟新药使用所取得的经验，完全可以造福于现在还饱受疟疾折磨的发展
重苎茎生塑鱼盛塑茎苎璺塑塞堕：查暨堑堕耋姿兰坌至坌塑——
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图１．青蒿素的化学结构
中国家的人民。因此，开展青蒿素生物合成研究，扩大青蒿素来源既有重大的经济效益，又有巨大的社会效益。
前面已经谈到疟疾是当今严重威胁人类生命的重要传染病之一，鉴于疟疾的高发区是热带和亚热带地区，而恰恰这些地区是贫穷落后的国家，如非洲、亚洲和拉丁美洲的一些国家。因此药品的价格定位成为能否实现为大多数贫困人民治病的关键问题。除政府的行为因素外，努力降低成本是商家寻的最重要的解决途径。为此，许多发达国家如美国、加拿大、日本、德国、瑞士、瑞典、比利时及荷兰等国的科学家都投入极大的关注。科学家们致力于青蒿素生物合成途径中间体，关键酶基因克隆及其分予水平调控的研究。试图通过青蒿素生物合成的基因调控，以大幅度提高青蒿中青蒿素的含量。我国作为青蒿素的发明国家，应当在这一最新的研究领域保持我们的领先地位。我们实验室多年来一直从事青蒿索生物合成途径及其代谢调控的研究，目前与国际上的同类研究工作相比，我们的工作总体上处于领先水、Ｆ。本论文便是我们实验室在青蒿素生物合成代谢途径中关键酶基因的克隆、功能特征等方面开展的一些研究工作。下面就国际上在青蒿素生物合成途径及其代谢调控方面的研究工作作一综述。
１．青蔫紊的入药
菏蒿入药，最早见于马王堆三号汉墓（约公元前１６８年）出土的帛书《五十二病方》”１。在《神农本草经》［４Ｊ宋《大观本草》和《重修政和经史证类备用本草》中汜载为药嵋１。青蒿疟疾，在公元２８１—３５０年，东晋葛洪的《肘后备急云》就