狂犬病毒自然感染和疫苗接种的免疫应答
发布时间：2011-6-22
      译者按未打疫苗致感染追责：为什么狂犬病毒自然感染会引起100%的病死率，而接种疫苗却能获得免疫力？本文提供迄今最全面的解答，涉及相关的详细病理学过程，可供相关专业人士参考。
      [摘要] 狂犬病毒感染会引起人类脑炎，其病死率几乎是100%。这种无法阻止的感染令人感到惊讶，因为暴露前接种疫苗或暴露后及时接种疫苗都可以高效阻止脑炎的发生。由接种疫苗产生的最重要的免疫学相关的保护因子是中和抗体。T辅助细胞有助于提高免疫力，然而细胞毒性T 细胞不但没有保护作用，并且事实上可能对宿主产生危害。尽管从暴露于病毒到发病可能有几个月的时间，狂犬病毒在人体并不能激发免疫系统产生保护作用，其中一个原因可能是由病毒诱导产生的免疫学应答太弱。极少有个体在病症刚出现时可检测到中和抗体，尽管在许多病例中，在出现更严重症状时可检测到抗体。此外，当血清中可以检测到抗体时，抗体却很少出现在脑脊液中，提示抗体仅非常有限地渗入到最需要它的部位——中枢神经系统(CNS)。一定数量的单核细胞浸润到大脑实质的作用尚不清楚。有一些研究表明，病毒在感染早期可以抑制细胞介导的免疫，但是尚没有机理方面的证据来支持这个论点，目前知道的仅仅是病毒磷蛋白对细胞内干扰素的产生有抑制作用。与此相反，CNS内的抗体水平与在CNS内病毒产量的峰值有关。这里，我们总结了当前对针对狂犬病毒自然感染和疫苗接种的免疫应答的理解。本文指出，有必要弄清狂犬病毒抗原在初期是怎样被提呈的，以及随后如何影响抗体反应的发展。这将有助于确定可增强预防接种应答的方法，并弄清如何增强抗感染的自然免疫应答，从而阻止病毒对神经系统的入侵。
 
      1. 前言                                                                                                                   
      像所有的狂犬样病毒属(Lyssavirus genus)的成员一样，狂犬病毒是嗜神经组织的，并且在咬伤发生后继而感染伤口附近的外周神经。然后病毒逆向沿轴突输送到背根神经节，在这里病毒的复制是可检测到的。在鼠类动物感染模型中，病毒移动极其迅速，足垫接种后截肢或者切断坐骨神经能够阻止病情的发展。然而，在实验模型中，这种剧烈的疗法在接种后的几天内就失去了功效。培养在大鼠感觉神经元中的狂犬病毒在轴浆中运输时速度达到12–24mm/天。这与该病在人体内的情况相矛盾，在人体内，从暴露到狂犬病发病的时间通常为数月，在一些极个别的病例中甚至是数年。据推测，在被咬位置附近的肌肉组织里，病毒可能以休眠状态或者极低水平的复制存在。在接种了低剂量狂犬病毒的条纹臭鼬中，过两个月就可以用RT-PCR检测到暴露部位附近组织中的狂犬病毒。免疫组化标记试验提示，这种病毒存在于条纹肌肉纤维细胞内。大量的细胞表面受体蛋白已经被鉴定出来，其中一种是乙酰胆碱受体，它在神经肌肉连接处被发现，能够促进狂犬病毒进入外周神经系统。
      一旦病毒进入到神经系统，经由脊髓到大脑的运动变得十分迅速，并且伴随病毒复制的爆炸性增加。最初疾病症状包括疼痛或者被咬处附近的感觉异常，并常伴有发烧、疲劳和四肢无力的症状。包括头疼和焦虑在内的非特异性神经系统症状常发生在明显脑炎发病前的许多天里，经常只有到了此时病人才会去寻求医疗帮助和住院。目前还没有有效的经过验证的方法，一旦疾病症状出现，依赖于临床干预的水平，死亡不可避免地会在若干天或若干星期内发生。
      狂犬病成功的依赖于暴露后立即做出反应。首先，清洁是高效且廉价的降低感染风险的方法。其次，适当的由疫苗和狂犬病免疫球蛋白组成的暴露后预防可以有效地防止疾病发生。应根据世界卫生组织(WHO)推荐的方案，肌肉或者皮下注射现代狂犬病疫苗，此类疫苗含来源于传代细胞系的灭活病毒。这种方案已经发展到能确保产生最佳的免疫应答，典型的该方案包括在四个星期内进行多次注射。
      针对此类病原体，我们提出了两个基本的问题。第一，它和免疫学有什么联系，第二，为什么受害者不能产生保护性应答来成功地消除感染或者减轻疾病的严重性。第一个问题已经有详细的解答，但是第二个问题仍然挑战着我们对狂犬病毒的致病性和免疫应答的理解。这个问题应该在承认下述事实的基础上来回答：这种疾病总是致命的，但是暴露并非必然导致发病。可能是因为并没有发生真正的病毒暴露，或者发生了暴露但是暴露刺激产生的免疫应答在早期就控制了病毒。在这两种情况下，那些个体并没有引起临床医生的注意，因而也研究得很少，所以尚不清楚天然的保护性应答是否有可能对抗狂犬病毒。对动物(特别是蝙蝠)中狂犬样病毒的血清学调查，经常能在健康个体中测检出阳性血清反应。设想它们是已经暴露给了有复制能力的病毒，尽管并不清楚这类现象如何能与现代感染模型相符。针对蝙蝠的又一个假设是：这是在洞穴内气溶胶暴露的结果。还有其他的解释：这种情况是反复暴露于低剂量病毒或者某种流产感染模式产生的，但是尚没有任何有力的证据来支持这些假设。
      2. 疫苗接种的免疫应答
      虽然有一小部分狂犬病感染幸存者，然而绝大部分发病的人都以死亡告终。尽管如此，在暴露前或暴露后迅速接种疫苗都能高效地阻止发病。巴斯德(Pasteur)在1885年最先倡导使用来源于狂犬病感染的兔子的干燥脊髓防治狂犬病。随后的疫苗仍然来源于各种动物源神经组织，这类疫苗既有效又能让在全世界范围内的人们都负担得起。然而，此类疫苗中含有的大量髓磷脂碱性蛋白会引起一小部分病例发生严重的脑炎。因此，现在不推荐使用这些疫苗。现代疫苗由来源于传代细胞系的灭活病毒组成。在英国有两种人用疫苗得到了注册许可：由安万特•巴斯德（Aventis Pasteur）公司生产的人二倍体细胞疫苗（HDCV）和凯龙（Chiron）公司生产的纯化鸡胚疫苗（PCECV）。针对卫生保健和实验室工作者以及到有狂犬病地方性流行的地区旅行的人，暴露前预防接种分3剂给药，分别在第0、7、28天进行肌肉注射。接种HDCV后4天可以检测到IgM类抗体，接种后7天出现IgG类抗体。后续的研究表明，接种后产生的应答反应可以持续存在两年之久，被动转移研究表明，只有IgG类抗体能最有效地针对病毒提供保护，很可能是因为IgM类抗体不能渗入组织。暴露后及时的或预防接种(PEP)是预防狂犬病的唯一有效处置方法。与暴露前疫苗接种不同，WHO推荐的PEP疗程由短期内的疫苗多次再加强组成。一个标准的过程应在第0、3、7、14和28天进行重复的肌肉注射。用皮下注射作为肌肉注射的替代疗法，其所用疫苗量较少，可以在资源有限时达到更高效率和低成本的效果。特别是在亚洲，这种途径得到了更广泛的承认。皮下注射比肌肉注射更能提高应答反应，原因被认为是从皮下进入可改进抗原的提呈，虽然这种解释还没有在狂犬病毒的实验中得到证实。
      疫苗的效价在判断狂犬病疫苗的效力上是一个关键因素，并且通常可反映一个特定批次的抗原含量和接种疫苗后诱导产生的抗体滴度。在人体或动物需要检测的关键参数是接种疫苗后诱导的中和抗体滴度。两种中和试验可用于这种检测：快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和荧光抗体中和试验（FAVN）。后一种检测用于依据现行宠物旅行方案在同行动物进入英国前检测其血清。而在欧洲，RFFIT已经用于监测通过食饵口服给狐狸种接种狂犬病疫苗是否成功。
      3. 狂犬病毒自然感染的免疫应答
      暴露后接种引发的抗病毒效力和大量实验研究都证明，主要的保护作用体现在中和抗体的存在。在基因敲除小鼠的感染实验模型中，缺少所有T淋巴细胞和B淋巴细胞的小鼠，以及只缺少B细胞的小鼠，都对狂犬病毒的减毒株易感；然而，仅仅缺少CD8阳性T淋巴细胞的小鼠却不易感。令人惊讶的是，在大部分人类狂犬病病例中，直到发展成为急性疾病后的一些天，才可以检测到抗体应答。在泰国的一项对狂犬病住院病人的研究中，11例病例中只有3例可以检测到针对病毒糖蛋白的中和抗体。即使在这些检测出抗体的病例中，抗体滴度也特别低，从0.26到3.42 IU/ml。对其中6人的脑脊液(CSF)进行了研究，没有检测到抗狂犬病抗体。美国有一个相似的人类病例回顾，在刚进医院时没有一个病人检测到抗狂犬病毒的中和抗体，尽管在入院10天内发生了血清转化的病人超过一半。在检测了脑脊髓液中抗体的14位病人中，只有两个人达到了可检测水平。图1是在英国的两个人狂犬病病例中也观测到抗体应答的延迟。在第一个病例中，抗狂犬病毒抗体滴度只出现在入院后的第16天。在第二个病例中，在住院一个星期后血清和CSF中都出现抗体（图1）。在英国早先的一个人狂犬病病例中，感染的是一种相关的病毒——欧洲蝙蝠狂犬病毒2型，在住院期间的任何时候都没有可检测到的抗病毒应答。最近几年内特别有趣的是美国的一个从蝙蝠源狂犬病毒中幸存的人类病例。这个病人住院时CSF和血清中都有可检测到的抗体并且方式包括在一定程度上的诱导昏迷，其目的就是为体液免疫应答的发展提供时间。CSF和血清中IgG值确有升高，并且这可能是该病人幸存的原因。 来自哥伦比亚和巴西的两个报道表明还有更多的幸存者，然而，大多数企图重复这种方法的病例至今还没有成功的。绝大多数病例中的病人都以死亡告终，病毒复制位点保护性抗体的缺乏很可能是造成生存率低的原因。图1中病人的血清学应答显示，血清转化发生在疾病的晚期，抗体没有在CSF中达到一个特别高的滴度，而是较快就达到平台期。对这个特定的病人来说，所有这些因素都可能导致失败的结果。特别是在病毒进入到大脑之前更迅速对感染产生应答的能力，以及抗体进入CNS的能力，有望能提高生存率或者限制病毒的扩散。已经观测到单克隆抗体的被动转移可以抑制细胞到细胞间病毒的传播，提示抗体有助于将病毒从CNS清除，不过将这种战略在人类中应用尚未取得成功。
      在感染期间，尚不清楚诱导抗体应答的抗原是来源于外周神经系统还是CNS的病毒。此外，啮齿动物感染实验模型在理解自然感染时有严重的局限性。在用致病病毒感染的叙利亚仓鼠模型中，IgG2 抗体早在感染后五天就被检测到。然而，经由腹腔注射感染的病毒可能需要到第8天才能有效地诱导抗狂犬病抗体。我们已观察到足垫接种能迅速诱导产生中和抗体（5天内）（图2）。还没有进行研究来确定这些抗体的同种型，而且血清中最早产生的抗体可能是IgM。对于这些研究需要注意的是所使用的病毒的数量比唾液自然传播的要多出很多。然而，在大多数动物实验中，在接种病毒后要确保一致地引发疾病，需要有这样高的病毒滴度。需要进一步改善这些动物模型使其能够更好地反映自然感染的实际情况。
      4. 狂犬病毒对宿主的免疫抑制
      宿主对自然感染的应答能力有限，其原因可能与许多因素有关。病毒的亲神经性导致绝大多数的复制首先发生在背根神经节，然后逐步到达CNS。习惯上CNS被认为是一种免疫豁免部位，不处于与其他器官相同的免疫监视水平之下。此外，免疫系统诱导炎症反应（如脑炎）的能力也受到严格的调控，以防止旁观者损伤从而导致宿主的神经元受连累。这种主张已经被更新的知识所替代，目前对大脑和脊髓的淋巴引流和CNS中细胞的转运都有更透彻的了解。然而，仅仅这些还不能解释对狂犬病毒的免疫失败，因为其它许多病毒也可以感染大脑，包括疱疹病毒和博纳病病毒（BDV），而在BDV持续感染的病例中，免疫系统的机能能有效地控制该病毒。
      第二个解释是可能通过咬伤进入的病毒量太少以至不能引起免疫应答，从而使得病毒有可能感染附近的感觉神经。这可能发生在很多情况下。蝙蝠似乎是狂犬病毒的有效传播者，但是其唾液中的病毒水平用RT-PCR几乎都检测不到。仅仅只在北美洲发现的一种狂犬病毒蝙蝠变异株能够适应以低剂量传播并适合在37◦C以下的温度复制。此温度与体表皮肤温度更相符，并且有越来越多的证据表明，用欧洲蝙蝠狂犬样病毒感染实验动物，皮下注射是一个比肌肉注射更有效的方法。
      抗体缺乏的最后一个解释是，这可能是病毒诱导的免疫抑制的结果，与全身免疫抑制和细胞水平的免疫抑制都可能有关。狂犬病毒感染造成淋巴细胞耗损的观察在20世纪80年代末期已经进行过。这种淋巴细胞减少症似乎影响到所有淋巴组织，包括胸腺、脾脏和淋巴结以及所有的细胞类型。之所以提出这种作用的原因是由于肾上腺激素对淋巴组织有毒性，因为在感染前切除肾上腺的小鼠没有遭受同样的耗损。免疫抑制的进一步证据表现为细胞介导的对丝裂原伴刀豆球蛋白A和狂犬病毒特异抗原的免疫应答减少。最近的研究表明，不是激素失调而是细胞因子引起了全身免疫抑制，特别是在感染过程中在CNS内产生的肿瘤坏死因子α（TNF-α）。这种说法被下述实验结果所支持：TNF-α受体基因敲除的小鼠在用有神经毒力的狂犬病毒攻击后提高了存活率。然而，在感染无毒毒株的小鼠大脑中TNF-α的转录增加了，并且我们没有观察到同时感染狂犬病毒和EBLV-2小鼠的血清中TNF-α有增加。另外，这许多免疫紊乱仅仅在发病时才在小鼠中观察到。在没有大规模的病毒复制和神经元损伤的情况下，不清楚免疫应答是怎样被抑制，特别是在咬伤事件后很快会遇到抗原的引流淋巴结中。有一些研究提示，淋巴细胞和巨噬细胞都对感染敏感，并且这些细胞的感染对所见到的细胞因子表达谱有显著影响。
      现已发现在病毒感染细胞内一个更可能的免疫抑制机制。最新的研究证明，在体外狂犬病毒能够抑制干扰素的作用。这是通过磷蛋白结合STAT异构体、抑制其在细胞质内的积聚，并打乱干扰素信号传递而实现的。也表现为抑制STAT二聚体迁移到细胞核、抑制干扰素及干扰素诱导基因的转录起始。然而，大量的研究表明，感染期间在CNS中产生了炎性细胞因子，说明在体内可能存在着其他的途径能够补偿这种抑制。从这些体内研究尚不能确定，CNS中的细胞因子是否直接来源于狂犬病毒的感染（例如来源于神经元），抑或是由旁观者细胞产生，抑或是由进入CNS的其它细胞产生。
      5. 结论
      CNS的免疫豁免状态和血脑屏障（BBB）可以解释保护性应答发生的一些延迟。只有在狂犬病毒进入到CNS后，病毒的复制才增加，所以在外周神经系统中抗原的水平很可能是被限制的。另外，尽管现在关于抗原在CNS的提呈和从脊髓及CNS到局部淋巴组织的快速迁移已有明确的证据，但这个过程仍可能延迟抗原提呈到合适的B细胞的时间，并且脾脏不太可能是对狂犬病毒产生免疫应答的一个重要部位。一旦B细胞被刺激，即成熟过程开始，然后就会启动抗体或者浆细胞释放到CNS。此外，实验模型表明，T细胞和B细胞都会浸润到背根神经节、脊髓和大脑（图3）。但是，这些细胞中大部分都是T细胞，而且其中大部分看来是在进入到CNS后便注定会迅速凋亡。而且在CNS中产生的免疫应答具有固有的复杂性。这些包括MHC表达的严格调控，在淋巴细胞中高水平的Fas介导细胞凋亡以及神经细胞免疫抑制因子的表达。在狂犬病毒感染期间BBB依然保持完整并且很可能排除抗体，尽管这种作用似乎并不完全,因为有一个报道表明,静脉注射的中和性单克隆抗体可以清除CNS中的病毒。不同病毒株之间的变异可能在经由CNS的传播速率、BBB的通透性和免疫应答发展的速度上起重要作用。大量的研究表明，病毒可抑制适应性免疫应答。有确切的证据证明，病毒磷蛋白可以抑制干扰素反应，尽管感染会增加干扰素诱导基因的基因转录。很有可能因为这种抑制是短暂的，仅使宿主应答产生短暂的延迟，从而给了病毒一个“抢先机会”。然而，这里存在一个悖论：在感染后期病毒负载量的水平最高，脑炎最严重，而此时也正是宿主免疫系统最活跃的时期。关于外周免疫应答的抑制更有争议，因为不清楚病毒是怎样到达像脾脏这种不容许病毒存在的器官的，并且病毒也没有产生已知的可溶性因子能够介导这种反应。
      有一篇单独的论文研究了包含在免疫剌激复合体中的狂犬病毒抗原的提呈。此研究展示了在静脉注射后脾脏边缘区的巨噬细胞对抗原的摄取，以及随后在巨噬细胞存在或在用氯膦酸盐脂质体处理致巨噬细胞耗尽后抗体反应的发生。现在还没有着眼于狂犬病毒抗原的提呈或狂犬病疫苗接种应答中B细胞成熟过程的研究。上述事实说明，狂犬病毒感染研究可能成为全方位研究抗体发展的典范，并且可用来识别在感染后期出现的浸润性淋巴细胞的来源。这将有助于理解为什么在自然感染期间不能产生足够的免疫反应，同时将有助于制定有效的战略在进行PEP时能增强免疫反应。
[ Vaccine  2010,  28: 3896-3891，杨露　胡蓉译　严家新校 ]