注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量分析方法的建立
雷小平杨明亮姚吉勰陈青连
（杭州澳亚生物技术股份有限公司杭州 310018）
摘要目的：建立高效液相谱法测定注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠的含量。方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C
18
谱柱（4.6 mm×250 mm，5 m m），以磷酸盐缓冲液-乙腈（90∶10）、乙腈进行梯度洗脱，流速为
1.0 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35 ℃，进样体积为20 m L。结果：依地酸二钠的检测不受其他成分干扰，不
同浓度依地酸二钠的回收率均在98.0%~102.0%之间，回收率RSD为0.39%，浓度在27.52~64.20 m g/mL范围内线性良好（r=1.000 0）。结论：本方法简便、迅速、专属性及重现性好，可用于注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量的测定。
关键词依地酸二钠注射用泮托拉唑钠含量高效液相谱法
中图分类号：O657.72; R975.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2022)05-0077-04
引用本文雷小平, 杨明亮, 姚吉勰, 等. 注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量分析方法的建立[J]. 上海医药, 2022, 43(5): 77-80.
Establishment of method for disodium edetate in pantoprazole sodium for injection
LEI Xiaoping, YANG Mingliang, YAO Jixie, CHEN Qinglian
(Hangzhou Ausia Biological Tech. Co., Ltd., Hangzhou 310018, China)
ABSTRACT Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of disodium edetate in pantoprazole sodium for injection. Methods: HPLC was performed using C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with gradient elution containing phosphate buffer-acetonitrile (90:10) (A) and acetonitrile (B) at a flow rate of 1.0 mL/min, detection wavelength 254 nm, column temperature 35 ℃ and sample volume 20 m L. Results: The determination of disodium edetate was not interfered by other components in the injection. The recovery rates of different concentrations of disodium edetate were between 98.0%-102.0% with RSD 0.39%. Standard curve of disodium edetate showed good linearity over the range of
27.52-64.20 m g/mL with r=1.000 0. Conclusion: This method is simple, rapid, specific and reproduceable and can be used for the
determination of disodium edetate in pantoprazole sodium for injection.
KEy WORDS disodium edetate; pantoprazole sodium for injection; assay; HPLC
依地酸和依地酸盐在药物制剂、化妆品和食品中被用作螯合剂，它们与碱土金属和重金属离子形成稳定的水溶性络合物（螯合剂）。由于螯合作用，具有一定的抗菌活性，一般情况下与其他防腐剂联用。依地酸和依地酸盐主要用作抗氧剂，螯合能催化自氧化反应的如铜、铁和锰等微量金属离子，既可以单独使用也可以与抗氧剂联合用[1]。
注射用泮托拉唑钠主要用于十二指肠溃疡、胃溃疡、急性胃黏膜病变、复合性胃溃疡等引起的急性上消化道出血[2-5]，其原研药品 Pantoloc（潘妥洛克）处方中含辅料依地酸二钠1 mg，根据《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》（国家药监局药审中心于2020年5月发布），若注射剂处方中含有抗氧剂、抑菌剂等辅料，在稳定性研究中还要考察这些辅料含量的变化情况，故需制定注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量的测定方法[6-9]。考虑到注射用泮托拉唑钠中辅料依地酸二钠的量及不同方法的灵敏度，故建立高效液相谱法作为检验方法[10]。
1 材料和方法
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相谱仪（德国安捷伦科技有限
作者简介：雷小平，工程师。从事药品研发和药品注册。E-mail：************************
通信作者：陈青连，高级工程师。从事药品研发和药品注册。E-mail：*************************
公司）；UltiMate 3000高效液相谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；XSE205DU天平（十万分之一）、ML204T天平（万分之一）[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]。
1.2 试药
注射用泮托拉唑钠（杭州澳亚生物技术股份有限公司，批号18092003、19030403、19102402，每瓶针剂含依地酸二钠1.0 mg）；依地酸二钠对照品[USP，批号R028C0；含量：90.32%（以无水物计）]；泮托拉唑钠倍半水合物（锦州九泰药业有限责任公司，批号20190103）；乙腈为谱纯（Tedia公司）；其余试剂均为市售分析纯。
1.3 方法
1.3.1 谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾2.7 g，加水1 000 mL，搅拌使溶解，加入10%四丁基氢氧化铵溶液10 mL，混匀）-乙腈（90∶10）为流动相A，乙腈为流动相B，梯度见表1；检测波长为254 nm；进样量：20 m L；柱温维持35 ℃；流速设为1.0 mL/min；运行时间为30 min。
1.3.2 样品配制
1）供试品溶液取注射用泮托拉唑钠1瓶，加水适量使溶解并转移至20 mL量瓶中，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水定容至刻度，摇匀后过滤。
2）对照品溶液精密称定依地酸二钠对照品20 mg，置20 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL置20 mL量瓶中，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为50 m g/mL的依地酸二钠溶液。
3）空白溶液量取0.05％硫酸铜溶液3 mL置20 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
4）空白处方溶液称取泮托拉唑钠约0.423 g（相当于0.4 g泮托拉唑，即10瓶注射用泮托拉唑钠中主成分处方量），置20 mL量瓶中，加入0.03 mol/L氢氧化钠辅料溶液2 mL，加水稀释至刻度。
5）空白处方（或供试品）酸或碱破坏溶液各取空白处方溶液2 mL置20 mL量瓶中（或取注射用泮托拉
唑钠1瓶），加入0.1 mol/L盐酸或氢氧化钠溶液2 mL，静置5 min后，加入0.1 mol/L氢氧化钠或盐酸溶液2 mL，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，过滤。
6）空白处方（或供试品）高温破坏溶液取原空白处方溶液2 mL（或取注射用泮托拉唑钠1瓶，加水适量，使溶解后）置20 mL量瓶中，在98~100 ℃水浴条件下加热30 min，取出，冷却至室温，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，过滤。
7）空白处方（或供试品）光照破坏溶液取置于光照强度为5 000 lx、紫外辐射强度为90 μw/cm2、温度为25.0 ℃的药品强光照射试验箱中10 d的空白处方溶液2 mL（或取注射用泮托拉唑钠1瓶，加水适量，使溶解）置20 mL量瓶中，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，过滤。
8）空白处方（或供试品）氧化破坏溶液取空白处方溶液2 mL置20 mL量瓶中（或取注射用泮托拉唑钠1瓶），加入0.1%过氧化氢溶液2 mL，加0.05％硫酸铜溶液3 mL，用水稀释至刻度，摇匀，过滤。
9）依地酸二钠溶液储备液精密称取依地酸二钠对照品20.31 mg，置于50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.366 9 mg/mL的依地酸二钠溶液储备液。
2 结果
2.1 专属性
取上述空白处方溶液和制剂的酸、碱、高温、光照、氧化破坏溶液，HPLC检测结果表明，空白溶液及各破坏样品中的杂质对检测均无干扰，表明方法专属性良好（图1）。
2.2 准确度
分别移取依地酸二钠溶液储备液2.0、2.5、3.0 mL 至20 mL量瓶中，加入空白处方溶液2 mL、0.05％硫酸
表1 流动相梯度
时间/min流动相A/%流动相B/% 0100 0
10100 0
11 2080
20 2080
20.1100 0
30100 0
铜溶液3 mL ，用水稀释至刻度，各水平平行测定3份。9份样品平均回收率为99.3%，RSD 为0.4%，表明方法准确度良好（表2）。
2.3 精密度2.
3.1 重复性
取一批注射用泮托拉唑钠平行配制6份供试品溶液，进行检测，含量结果平均值为0.982 mg ，RSD 为0.34%，表明方法重复性良好。
2.3.2 中间精密度
两分析人员分别对同一批注射用泮托拉唑钠平行配
制6份供试品溶液，不同日期、不同仪器分别进行检测，6份的含量结果平均值分别为0.982、0.972 mg ，RSD 分别为0.34%、0.42%，12份的含量结果平均值0.977 mg ，RSD 为0.62%，表明方法精密度良好。
2.4 线性
分别移取依地酸二钠溶液储备液（质量浓度：0.366 9 mg/mL ）1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 分别置20 mL 量瓶中，加0.05％硫酸铜溶液3 mL ，用水稀释至刻度，摇匀，进行检测。将依地酸二钠峰面积对浓度进行线性回归，所得线性方程为A=10.950 4C －1.674 4，相关系数r =1.000 0。结果表明在27.52~64.20 m g/mL 质量浓度范围内，依地酸二钠的峰面积与浓度的线性关系良好。
2.5 耐用性
2.5.1 谱条件耐用性
分别改变流动相组成（流动相A 中磷酸盐缓冲液与乙腈的比例88∶12、92∶8；缓冲液盐浓度0.018 mol/L 、0.022 mol/L ）、柱温（33 ℃、37 ℃）、流速（0.8 mL/min 、1.2 mL/min ）、谱柱（3根）、检测波长（252 nm 、256 nm ）进行检测，其系统适用性均满足要求，且含量检测结果与初始条件的相对偏差均不大于2%，故认为本方法耐用性良好（表3）。
图1 专属性HPLC
图谱
表2 准确度试验结果
浓度/%加样浓度/(m g·mL -1
）检测浓度/(m g·mL -1
）回收率/%平均回收率/%RSD/%80
36.69
36.5599.699.3
0.4
36.6699.936.28
98.910045.8645.8299.945.5999.445.51
99.212055.0354.4598.954.5499.154.59
99.2
2.5.2 溶液稳定性
分别考察对照品溶液及供试品溶液在室温及冷藏条件下的溶液稳定性，于放置0、12、24、36、48、60、72 h时进行检测，72 h内，供试品溶液与初始值之比在室温条件下为98.8%~100.5%，冷藏条件下为100.0%~100.6%；对照品溶液与初始值之比在室温条件下为99.7%~100.2%，冷藏条件下为99.7%~100.1%，表明供试品溶液及对照品溶液在室温、冷藏条件下72 h内稳定性均良好。
2.6 样品的检测
对3批注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量进行检测，结果分别为0.979、0.988、0.976 mg。
3 讨论
依地酸二钠有四个pKa，分别为1.99、2.67、6.16、10.26，在推荐的流动相pH（2~8）范围内，依地酸二钠容易存在不同的解离状态，导致其在谱柱上的保留行为不一致，故使用络合剂进行络合后检测。本方法使用硫酸铜作为络合剂，研究发现，硫酸铜浓度太高空白溶液的谱图基线不稳定，太低会使依地酸二钠无法完全反应，故对比后选择0.05%的硫酸铜溶液作为络合剂。注射用泮托拉唑钠加0.05％硫酸铜溶液配制后，会产生浑浊，故对过滤前后及不同过滤体积时的检测结果进行对比，结果均无差异，故检测前需对供试品溶液进行过滤。
由于泮托拉唑钠稳定性不好，在酸、高温、氧化破坏后容易产生杂质干扰依地酸二钠的检测，故对无
依地酸二钠的注射用泮托拉唑钠处方溶液进行破坏，确认产生的破坏杂质在依地酸二钠保留时间位置的出峰情况，采用本方法进行检测，各破坏样品中的杂质对依地酸二钠检测均不存在干扰。
表2中的回收率结果表明，3 mL 0.05％硫酸铜溶液用于注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠的络合反应是充足的。对流动相A中磷酸盐缓冲液与乙腈的比例、缓冲液盐浓度、柱温、流速、谱柱、检测波长进行微小的调整，均能满足系统适用性试验的要求，且对照品及供试品溶液在72 h内稳定，临用新制。
综上所述，本方法专属性、准确度、精密度、线性、耐用性均良好，适用于注射用泮托拉唑钠中依地酸二钠含量的检测。
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（收稿日期：2021-03-30）
表3 谱条件耐用性结果
条件
液是否
干扰
1峰面积的
RSD/%
液2的回
收率/%
含量
相对
偏差
原条件无干扰0.27 99.6 98.2NA 比例88∶12无干扰0.19100.6 99.40.61比例92∶8无干扰0.10100.2 98.20.00 0.018 mol/L无干扰0.50100.2 99.00.41 0.022 mol/L无干扰0.10100.6 98.40.10 33 ℃无干扰0.15100.5 99.60.71 37 ℃无干扰0.08 99.9100.00.91
0.8 mL/min无干扰0.07100.7 99.50.66
1.2 mL/min无干扰0.15100.2 97.80.20谱柱2无干扰0.16100.7101.0 1.41谱柱3无干扰0.19100.61
00.9 1.36 252 nm无干扰0.23100.0 98.70.25 256 nm无干扰0.12100.3 99.70.76
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