细菌生长的影响
张镇川1，何
冰2，李
甜1，靳亚忠3*，耿雪青1*
（1.上海交通大学农业与生物学院，上海
200240；2.西宁市农产品质量安全检测中心，西宁
810016；
3.黑龙江八一农垦大学园艺园林学院，黑龙江大庆
163319）
摘要:【目的】探究冠菌素（coronatine ，COR ）在丁香假单胞菌与番茄互作过程中的作用机理。【
方法】以番茄品种Money maker 为试验材料，用RT-qPCR 法检测不同浓度COR 注射番茄叶片之后防御基因表达量，利用苯胺蓝染法观测叶片中不同菌株诱导的胼胝质沉积数目，采用稀释平板计数法检测细菌生长量。【结果】RT-qPCR 结果显示高浓度COR 处理番茄可诱导EIN2、EIN3、LoxD 、MYC2、PAL5基因的高表达，抑制PR1a 基因的表达；细菌生长测定结果显示野生型病原菌比COR 缺失突变体在番茄叶片中的生长量高5倍；染观测结果显示COR 能够抑制番茄胼胝质的沉积。【结论】COR 影响番茄激素信号途径，抑制胼胝质沉积，促进病原菌在番茄叶片中的生长。关键词：冠菌素；丁香假单胞菌；基因表达；胼胝质；细菌生长中图分类号:S641.2
文献标志码:Ａ
文章编号:1000-2650（2021）01-0027-08
The Effect of Coronatine on Tomato Defense Gene Expression ，
Callose Deposition and Bacterial Growth
ZHANG Zhenchuan 1，HE Bing 2，LI Tian 1，JIN Yazhong 3*，GENG Xueqing 1*
（1.School of Agriculture and Biology ，Shanghai Jiao Tong University,Dongchuan Road 800，Minhang District ，Shanghai 200240，China ；2.Institute of Quality and Safety Testing Center for Ag
ro-Products in Xining City ，Biology District of Chengbei District ，Xining 810016，China ；3.College of Hoticulture and Landscape Architectrue ，Heilongjiang Bayi
Agricultural University ，Daqing 163319，Heilongjiang ，China ）
Abstract:【Objective 】To investigate the meachanism of coronatine (COR)function during Pseudomonas syringae and tomato interaction.【Method 】Using tomato variety Money maker as the test material ，RT-qPCR was used to detect the expression of defense genes in tomato leaves after the injection of different concentrations of COR ，and the aniline blue staining method was used to observe the number of callose deposits induced by different strains in leaves ，using a series of dilution plate counting method detects bacterial growth.【Result 】RT-qPCR results showed that high concentra -
tion COR treatment could induce high expression of EIN2，EIN3，LoxD ，MYC2，PAL5，and in -hibited the expression of PR1a .the results of growth curve assays showed that wild-type pathogenic bacteria can obtain greater population density in tomato leaves than COR deletion mutants;staining observation results showed that COR could inhibit callose deposition.【Conclusion 】COR is involved
第39卷第1期2021年2月
收稿日期:2020-12-23
基金项目：上海市科委一带一路国际交流合作项目：冠菌素介导番茄细菌性斑点病原菌对番茄的致病机理研究（19390743400）。
作者简介：张镇川，硕士研究生。*责任作者：靳亚忠，博士，副教授，主要从事设施蔬菜栽培生理学研究，E-mail ：jyz-hsp@126 ；耿雪青，博士，副研究员，主要从事番茄与不同病原物互作机制的研究，番茄逆境激素信号途径研究，E-mail ：xqgeng@sjtu.edu 。
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Agricultural University
doi ：10.16036/j.issn.1000-2650.2021.01.005
Vol.39
No.1
Feb .2021
第39卷
四川农业大学学报
in regulating the tomato hormone pathways，inhibiting callose deposition，and promoting the growth of pathogenic bacteria in tomato leaves.
Keywords:coronatine；Pseudomonas syringae；defense genes;callose；bacterial growth
番茄（Solanum lycopersicum）是一种在世界范围内广泛种植的蔬菜作物。番茄病害会严重影响番茄果实的产量和品质，制约了番茄产业的发展。番茄细菌性斑点病是一种严重的细菌性病害，主要危害番茄植株的叶片、茎和果实，造成5%~75%的减产，同时影响果实的外观[1]。近年来，我国广西等地有该
病害爆发的报道，发病率高达80%[2]。鉴于其严重的
危害性，该病害已被列入我国的出入境检疫有害生物名录[1]。
丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas ato是番茄细菌性斑点病的致病菌，冠菌素（coronatine，COR）是其分泌的一种化合物[3]。黄化
症状是番茄细菌性斑点病发展后期的典型病状，外源COR处理能够诱导番茄叶片变黄，表明COR作为致病因子在病害发展过程中发挥重要作用[4]。COR的分子式为C18H25NO4，由冠烷酸（CMA）和冠菌酸（CFA）通过酰胺键缩合而得[5]。冠烷酸与乙烯
合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸酯（ACC）结构类似，而冠菌酸与茉莉酸（JA）结构相似[6]。COR与茉莉酸异亮氨酸（JA-Ile），都能与宿主细胞上的茉莉酸受体蛋白COI1特异结合[7]。
植物内源激素在植物防御反应中发挥着重要作用，乙烯[8]、茉莉酸[9]和水杨酸[10]是参与植物防御的关键激素。乙烯和茉莉酸在抵抗死体营养病原体上发挥着协同作用，而水杨酸主要介导植物抵抗半活体营养病原菌和活体营养病原体的防御反应[11]。EIN2是一种跨膜蛋白，其半衰期很短，是乙烯信号通路的正调节因子[12]。EIN3也是乙烯信号通路的正调节因子，定位于细胞核中，是EIN2的下游调节蛋白，作为转录因子激活乙烯响应基因的转录[13]。脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）催化亚麻酸氧化生成13-氢过氧化亚麻酸，该反应是茉莉酸生物合成的第一步反应，因此LOX对于茉莉酸的生物合成至关重要，其编码基因LoxD常被作为茉莉酸通路标记基因[14]。MYC2转录因子是茉莉酸信号通路的重要蛋白，能够激活茉莉酸信号传导途径[15]。病程相关蛋白PR1a由水杨酸诱导产生，被用作水杨酸
信号通路的标记蛋白[16]。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是苯丙烷代谢途径的关键酶，木质素、酚类、黄酮类等多种次级代谢产物是通过苯丙烷代谢途径生成的，这些次级代谢产物在植物防御中发挥着重要作用，因此PAL是植物体内的重要防御酶[17]。
植物叶片是病原细菌危害植物的主要组织，细菌生长能力测定可以反映不同菌株在植物组织中的寄生能力，进而判断菌株的毒性[3]。植物在病原菌入侵时会激活自身的防御反应，胼胝质介导的细胞壁增强是一种常见的基础防御。接种病原细菌到叶片中数小时后，可以在接种叶片的细胞壁和细胞膜之间观测到胼胝质沉积[18]。
目前国内外对COR的研究主要集中在模式植物拟南芥上，而COR在番茄植株上的生理功能及其在细菌致病过程中发挥的作用还不是很清楚。本试验通过RT-qPCR技术测定不同浓度COR处理之后的番茄叶片的防御基因表达量，揭示了不同浓度下COR的生理功能；通过细菌生长曲线和胼胝质沉积数量的测定，并结合基因表达量的分析结果，证明了丁香假单胞菌分泌的COR能够促进细菌的毒性，初步探索了COR促进病原菌毒性增强的机理，为番茄细菌病害防控提供了理论依据。
1材料和方法
1.1试验材料
①植物：以感病番茄品种“Money maker”为试验材料，种子来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所馈赠。
②菌株：野生型致病菌P.ato DC3000（以下简称Pto）和不能产生COR的突变体cor-，以上菌株均来源于美国俄亥俄州立大学Dr. Daivd Mackey实验室馈赠。Pto菌株携带利福平抗性，cor-菌株携带利福平抗性和卡那霉素抗性。③试剂：冠菌素（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；Trizol试剂（上海厚凯生物科技有限公司）；TB Green TM Premix Ex Taq TM II（日本宝生物公司）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（日本宝生物公司）；苯胺蓝（国药集团化学试剂有限公司）；苯酚（上海泰坦科技股份有限公司）；乳酸（上海凌峰化学试剂有限公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；配置KB培养基试剂：蛋白胨、磷酸氢二钾、甘油和硫酸镁（国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（上海泰坦科技股份有限公司）；氯化镁（国药
28
张镇川，等：冠菌素对番茄防御基因表达、胼胝质沉积及细菌生长的影响第1期
表1RT-qPCR分析引物
Table1Primers used in RT-qPCR analysis
基因编号Gene number LOC101260631
LOC544185
LOC544009
LOC544165
LOC543928
LOC101249950
LOC101244220基因名称
Gene name
Acitn
PR1a
LoxD
MYC2
EIN2
EIN3
PAL5
引物序列
Primer sequence
F：5'-GATGGTGGGTATGGGTCAAA-3'
R：5'-AGGGGCTTCAGTTAGGAGGA-3'
F：5'-CATCCCGAGCACAAAACTAT-3'
R：5'-CGAGCCCGACCACAACCT-3'
F：5'-GTGTTGTCACTCCGCCTGTT-3'
R：5'-GCCAAGCCGTTAATTTCTAG-3'
何冰F：5'-GATTTCTCAAGTCCGTCTGTG-3'
R：5'-GAACCTTCTTCCGATGCTCC-3'
F：5'-CCCACTGCGGAGAAGGTT-3'
R：5'-CCAGCCGGAATTTGAAGAC-3'
F：5'-AAACCGCCATACAGAAAGCC-3'
R：5'-CTCTCCTTAGCAGTCATCTTGTC-3'
F：5'-CATCAACCTATCTCGTGGCG-3'
R：5'-CATCAAAGGGTAGGTGGAGC-3'
集团化学试剂有限公司）；利福平（上海凌峰化学试剂有限公司）；卡那霉素（上海贤鼎生物科技有限公司）。
1.2植物和细菌培养
将番茄种子于55℃水浴中浸泡催芽，待种子出芽之后播种至穴盘中，将草炭∶蛭石∶珍珠岩以3∶1∶1的比例均匀混合为培养基质。将穴盘放于恒温光照培养箱中进行培养，培养条件为：25℃恒温光照12h，18℃恒温黑暗12h。待幼苗长至2叶1心后，移苗至盆中放于恒温光照培养箱中培养。幼苗长至5叶1心后选取长势相当的健康植株用于试验。
将Pto接种至含有利福平（50μg/mL）的KB固体培养基中；将cor-接种至含有卡那霉素（100μg/mL）和利福平（50μg/mL）的KB固体培养基中。平板倒置于28℃恒温培养箱中，培养14~16h。
1.3番茄叶片的COR处理
将COR溶解配置为1μmol/L（高浓度）、0.1μmol/L（较高浓度）、0.01μmol/L（较低浓度）、0.001μmol/L（低浓度）4个浓度的COR溶液，选取第3、4片复叶中较大的5片小叶进行处理，用1mL无菌注射器（去注射器针头）将不同浓度COR溶液注射进番茄叶片中，每片小叶注射溶液量约为1mL，以去离子水作为对照组，每个组至少处理15片小叶。24h后取样，用液氮速冻叶片之后存放于-80℃冰箱中用于后续实验。
1.4基因表达差异分析
将COR处理后的番茄叶片于液氮中研磨至粉
末状，取100mg混合均匀的样品，采用Trizol法提取总RNA[19]。利用反转录试剂盒将总RNA反转录得
到cDNA。利用Primer5设计7对引物（表1），测定不同处理下叶片中的PR1a、LoxD、MYC2、EIN2、EIN3和PAL5基因的相对表达量，以番茄Actin基因作为内参基因。在CFX96实时荧光定量分析仪（Bio-Rad上海有限公司）上进行RT-qPCR反应。反应程序为：95℃预变性30s，反应循环“95℃变性5s，60℃退火延伸30s”，共设置40个循环。采用2-ΔΔCt 法计算基因相对表达量[20]。本次试验设置3次生物
学重复。
1.5细菌生长能力测定
用10mmol/L MgCl2溶液将KB固体培养基上
活化培养的细菌菌落重悬，稀释菌液直至OD600=0.2。将OD600=0.2的菌液（浓度为1×108CFU/mL）稀释1000倍，用1mL无菌注射器注射菌液到叶片中，每片小叶注射菌液量约为1mL，72h后用打孔器随机在接种过细菌的叶片上打孔取样，每个处理取9个叶圆片，用研磨仪研磨叶片，梯度稀释菌液之后取10μL菌液滴于KB固体培养基上，待菌液自然挥发之后倒置于28℃培养箱中进行培养48h。选取CFU（Colony-Forming Units）在20~100范围内的梯度进行计数，每个梯度至少3次计数后取平均值计数。本实验设置3次生物学重复。
1.6胼胝质沉积分析
用1mL无菌注射器注射OD600=0.2的菌液到叶片中，每片小叶注射菌液量约为1mL，以10mmol/L
29
MgCl2溶液作为对照。以水∶甘油∶苯酚∶乳酸∶乙醇= 1∶1∶1∶1∶2的体积比配置脱液，胼胝质是一种相对较晚的植物防御指标，在接种细菌到叶片15h后能够在叶片中被观测到，我们将处理15h后的叶片浸没在脱液中过夜脱。用去离子水和50%乙醇交替冲洗叶片3次，采用0.01%水溶性苯胺蓝将叶片胼胝质染，染时间为30min。染结束后用去离子水洗去叶片上的染液，移到载玻片后制成叶片标本放于荧光显微镜紫外波长下观察，保存图像。采用Image J 软件统计胼胝质沉积数量。每个处理组取至少取5片叶片进行观察，每片叶片至少选取3个不同视野区域进行统计。本实验设置3次生物学重复。1.7数据处理
使用IBM SPSS Statistic20进行差异显著分析，采用Excel软件绘图。
2结果与分析
2.1COR处理番茄叶片后基因表达分析
2.1.1乙烯信号途径相关基因的相对表达量
从图1中可以看出，所有处理组中的EIN2基因和EIN3基因的表达量均显著高于对照组。对于EIN2基因来说，各处理组中表达量最高的为1μmol/L组，相对表达量最低的为0.001μmol/L组，1μmol/L组的表达量显著高于0.1μmol/L组，0.01μmol/L组，和0.001μmol/L组。0.1μmol/L组，0.01μmol/L组和0.001μmol/L浓度的COR诱导EIN2没有显著差异。与EIN2基因表达类似，EIN3基因相对表达量最高的处理组为1μmol/L组，显著高于其他3个处理组，表明COR在高浓度时对EIN2基因和EIN3基因具有较强的诱导作用。
2.1.2茉莉酸合成和信号途径相关基因的相对表达量
从图2可以看出，除0.1μmol/L外，其他处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量均与对照组差异显著，且同一处理组中两个基因的变化趋势相同。1μmol/L COR处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量显著高于对照组，表明高浓度COR 能够诱导番茄叶片表达LoxD基因和MYC2基因。
0.01μmol/L COR处理组和0.001μmol/L COR处理组中的LoxD基因和MYC2基因的表达量显著低于对照组，表明低浓度和较低浓度COR处理抑制了番茄叶片LoxD基因和MYC2基因的表达。2.1.3PR1a基因的相对表达量
从图3中可以看出，除1μmol/L处理组外，其余各处理组PR1a基因的表达量均低于对照组，其他处理组与对照组间差异显著，0.1μmol/L处理组分别与0.01μmol/L和0.001μmol/L处理组均无明显差异，而0.0
1μmol/L和0.001μmol/L处理组差异显著，整体来说COR能够抑制叶片PR1a基因的表达。0.01μmol/L处理组的PR1a基因表达量在4个处理组中最低，仅为1μmol/L处理组的0.24倍，较低浓度COR对PR1a基因表达的抑制作用最强。
2.1.4PAL5基因的相对表达量
从图4中可以看出，各浓度COR处理番茄叶片均能诱导PAL5基因的表达。1、0.1、0.01、0.001μmol/L 处理组的PAL5基因平均相对表达量分别
为柱形图中不同小写字母表示P<0.05条件下差异显著性，下同。
Different lower case letters among columns indicate statis-tically significant differences at P<0.05.The same as below.
图1不同浓度COR处理下乙烯相关基因的表达水平Figure1The expression level of ethylene-related genes under different COR concentration of treatment
图2不同浓度COR处理下茉莉酸相关基因的表达水平Figure2The expression level of jasmonic acid-related genes under different COR concentration of
treatment
第39卷
四川农业大学学报30
图3
不同浓度COR 处理下PR1a 基因的表达水平
Figure 3
The expression level of PR1a gene under different COR concertation of
treatment
307.11、241.76、169.35和171.39。0.1μmol/L 处理组
分别与1μmol/L 和0.01μmol/L 处理组之间无明显差异，0.01μmol/L 处理组和0.001μmol/L 处理组无明显差异。总的来说，随着COR 浓度的增高，PAL5基因的表达量呈上升趋势。2.2细菌生长能力测定
从图5中可以看出，野生型菌株Pto 在番茄叶片中的生长能力极显著高于COR 缺失突变体cor-。同一接种浓度下接种不同菌株72h 后，叶片中Pto 的种密度为7.32×107CFU/cm 2，cor-的种密度为1.44×107CFU/cm 2，Pto 的种密度约为cor-的5倍，表明病原菌不能分泌冠菌素后，病原菌的生长量明显减少，说明COR 能够促进病原菌在宿主植物中的生长。
2.3
胼胝质沉积分析
胼胝质是植物抵御病原菌入侵的物理屏障。从图6中可以看出，处理组诱导的胼胝质沉积数量极显著高于对照组，同时Pto 处理组的胼胝质沉积数量极显著低于cor-处理组。荧光染叶片观测结果表明，接种细菌之后，番茄叶片启动诱导胼胝质沉积的基础防御，而COR 促进细菌一定程度上抑制胼胝质沉积，从而抑制植物防御。
3讨论与结论
COR 是P.ato 分泌的一种化合物，其分子结构同茉莉酸衍生物茉莉酸异亮氨酸极其相似。茉莉酸异亮氨酸是植物激素茉莉酸的生物活性物质，茉莉酸以茉莉酸异亮氨酸的活性形式同受体蛋白COI 结合从而激活茉莉酸信号转导途径[7]。COR 是病原菌分泌的毒性因子，作为茉莉酸异亮氨酸的结构类似物，在番茄中与受体蛋白COI1的亲和力高于茉莉酸异亮氨酸，在植物激素途径中发挥
着与茉莉酸相似的调节作用[4，7]
。Uppalapati 等[4]对冠菌素、冠烷酸、冠菌酸和茉莉酸甲酯的作用进行了研究，发现COR 相较于冠菌酸和冠烷酸具有更强的生物活性，茉莉酸甲酯诱导基因中有大约40%的基因也能被COR 诱导表达。
本试验利用RT-qPCR 技术测得不同浓度COR 处理条件下茉莉酸、水杨酸、乙烯相关基因以及PAL5的相对表达量。对于茉莉酸相关基因来说，不同的COR 注射浓度会呈现出不同的调节作用，高浓度的COR 处理上调表达了MYC2基因和LoxD 基因，低浓度和较低浓度的COR 处理会导致番茄叶
片
图4不同浓度COR 处理下PAL5基因的表达水平
Figure 4
The expression level of PAL5gene under different COR concertation of treatment
**表示差异极显著（P <0.01）。
**means extremely significant difference at 0.01level.
图5
不同菌株生长能力测定Figure 5
Determination of growth ability of
different strains
张镇川，等：冠菌素对番茄防御基因表达、胼胝质沉积及细菌生长的影响第1期31
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