mNGS技术在免疫缺陷重症肺炎患者病原体诊断中的意义
摘要：目的：探究mNGS技术在免疫缺陷重症肺炎患者病原体诊断中的意义。报告如下。方法：选取66例于2020年2月到2022年2月在我院进行的免疫缺陷重症肺炎患者，经过mNGS检测分为两组，一组检出组，一组未检出组，对患者进行对照研究。结果：经mNGS检验55例致病菌被检出，mNGS检出率高达92.42%，显著高于常规培养法的51.52%，而且两种检验办法在微生物、结核和支原体感染性上都没有显著差异(P>0.05)。结论：mNGS在免疫缺陷重症肺炎的监测中发挥了重要作用，它具有迅速、无偏的特点，可以有效地弥补传统病因学方法的缺陷，具有较高的应用价值。
关键词：mNGS  免疫缺陷  重症肺炎  病原体诊断 意义
Abstract: Objective: To explore the significance of mNGS technology in the diagnosis of pathogens in patients with severe immunodeficiency pneumonia. The report is as follows. Methods: 66 patients with severe immunodeficiency pneumonia treated in our hospital from February 2020 to February 2022 were pided into two groups after mNGS test, one detected group and one undetected group, and the patients were subjected for control study. Results:
By mNGS test, the detection rate of mNGS was as high as 92.42%, significantly higher than 51.52% of the conventional culture method, and there was no significant difference in microorganism, tuberculosis and mycoplasma infectivity between the two test methods (P> 0.05). Conclusion: mNGS plays an important role in the monitoring of immunodeficiency and severe pneumonia. It is rapid and unbiased, which can effectively compensate for the defects of traditional etiology methods and has high application value.
Key words: mNGS immunodeficiency, diagnostic significance of severe pneumonia pathogen
引言
重症肺炎在呼吸系统疾病中极为常见，咳嗽、咳痰、呼吸困难等是其主要症状，这种病症极难，病死率高。由于免疫系统缺陷，人体无法对外来的病菌产生有效的抵抗，因此更容易患重症感染。对患者的重症肺炎的早期诊断是重症肺炎的关键环节，而当前对于重症肺炎的检测方法主要是培养皿法，有很大的局限性。因此，准确地检测重症肺炎的前期病症，及时采取手段，将有助于患者的，进而提升患者的生存品质。分子和
基因诊断是当前感染性疾病病原学研究的重要领域，并且正在成为研究热点。宏基因组学测序(mNGS)是一种快速、准确的基因检测技术，它可以将待测样品的RNA或DNA杂交测序，同时与病原菌数据库进行比对，从而一次性筛选出多种病原菌，能够高效地进行检测，得出更准确的结果[1]。
一、一般资料
从2020年2月至2022年2月，我院共收治了66例免疫缺陷重症肺炎患者，当中男子32例，女子34例，年纪介于31~49岁，平均值年纪为39.28±9.12岁。当中，8例患者结合HIV，19例患者结合风湿免疫力疾患，17例患者结合血流系统疾病，4例患者进行脏器转移，18例患者近期进行化疗，这些患者均进行mNGS检查和致病菌培育，以搜集患者的早期临床资源，以便进一步研究免疫缺陷重症肺病的诊断和方法。经过mNGS检查，我们将患者分成两组：一组50例，另一组16例。在经过我院伦理委员会的审查和病人及其家人的知情同意后，本项目正式启动。
纳入标准：(1)患者处于免疫抑制状态；( 2 )患者被确诊为重症肺炎；(3)患者年龄大于18岁。
排除标准：(1)患者的临床资料不完整；(2)哺乳期妇女；(3)不同意ICF。
如果身体出现以下9种情况，则认为患者处于免疫抑制阶段：(1)患有不良血液病；(2)HIV病毒感染，不论CD4+淋巴细胞计数质量如何；(3)曾进行过具体器官移植手术；(4)在过去3个月内，每天使用泼尼松超过15mg，或是每天使用等量的其他类固醇激素超过21天；(5)在过去1年内进行过骨髓转移，或是在骨髓移植后患有移植物抗宿主病；(6)在过去3个月内，曾使用过环袍素或硫哇嗓吟；（7）在入院前9个月内，甲氨蝶呤的使用量超过每周12.25mg；（8）以及6个月内进行化疗或1个月内进行放疗的病史；（9）低丙种球蛋白血症，其中包括功能性或结构性脾功能亢进[2]。
二、研究方法
在第2天，抽出病人5ml空腹静脉血，并利用全自动生化分析仪对其开展了血常规测定、C反应蛋白、降钙素原和中性粒细胞计数等。此外，我们还从肺泡灌洗液中留取了约二十毫升，用于传统病原学检验和mNGS检验。
通过MNGS测试，我们将试样划分两组：一组是检出组，另一组是未检出组。(1)抽取试样，
对试样经过灭活和去黏度处理过程后，抽取患者核酸；(2)控制，测序数据量不小于20M，除去人源系列的比例超过90%，其中检出顺序的读长要求超过50bp；(3)资料筛选，除去低品质的系列，以保证测序成果统计的准确度和可靠性。为了得到高品质的测序资料，我们必须通过系列比较，将比对后的系列与病原信息库中的参考系列加以比较，以保证资料的准确度，从而更好地评估病原微生物的存在情况[3]。
三、统计学方法
使用SPSS22.0实现处理和分析方法，测量资料以元±s的方式显示，组间对比使用t检验，测量资料以率的方式显示，组间对比使用X检测，P<0.05值小于P<0.05时，表明误差具有统计价值。
四、结果
1、患者临床检验指标
数据表明，mNGS测试组各项检测指标均明显高于未测试组(P<0.05)，具体情况可参见表1。
表1两组患者临床检验指标比较
组别
例数
白细胞计数
（109/L）
中性粒细胞计数
（109/L）
降钙素原
（g/L）
C反应蛋白
（mg/L）
检出组
50
22.51±4.03
12.38±2.11
4.99±0.86
129.68±20.38
未检出组
16
11.28±3.33
6.03±1.18
2.01±0.67
77.24±12.69
X/t值
6.895
4.336
4.256
7.235
P值
0.000
0.002
0.000
0.000
2、 mNGS 与传统检测方法结果比较
经mNGS检验55例致病菌被检出，mNGS检出率高达92.42%，显著高于常规培养法的51.52%，而且两种检验办法在微生物、结核和支原体感染性上都没有显著差异(P>0.05)，但在菌类感染领域，mNGS检出率显然高于传统检测办法(P<0.05)，具体情况可参见表2。
表2  mNCS 与传统检测方法患者结果比较
项目
细菌感染
真菌感染
结核
支原体
总检测率（%）
mNGS
35
15
李倩资料
5
6
92.42
传统检测法
21
5
4
4
51.52
X2值
0.113
4.986
0.563
0.289
5.001
P值
0.001
0.000
0.001
0.000
0.000
在进行检测之前，应采用抗生素来提高两者的检测率。
在66例病人中，45例病人在检查前服用了抗生素，而21例病人则没有服用，因此，mNGS与传统培养法的检出率没有显著差异(P=0.124)。然而，针对已经服用抗生素的病人，mNGS的检出率显然优于传统培养法，而且这种差异不受抗生素品种的限制[4]。
五、mNGS目前存在的问题
随着二代测序技术的发展，研究表明，在身体健康体血样中可以监测到各种细菌的顺序，特别是呼吸道感染病人，因而，准确识别出监测到的细菌是否为致细菌、污染菌或定植菌，变得尤为重要。通过.cfDNA定量分析，可以获得DNA系列数、覆盖度和相对丰度等数据，这些数据可以有助于我们判定病原菌的特性。在脓毒血症病人分析中，Grumaz等人给出的脓毒症指数可以综合考虑系列数的绝对值和它们与正常值之间的差异，从而更准确地判定病原菌的特性。当病原菌的序列数达到阈值时，使用脓毒症指数比仅仅根据序列数据做出诊断更加科学，因此，cfDNA定量分析可以为我们提供更准确的诊断结果，从而更好地控制病原菌的传播。尽管样本量有限，但仍值得借鉴[5]。
由于各个基因测试机构的细菌数据库谱存在差异，或许会造成某些稀有的病原菌无法被准确测试出来；此外，送检标本的体积和坏死成分的多少，如果大部分或全部都是坏死成分，也会对测试结论造成一定的影响[6-8]。
理论上，死菌产生的DNA也可以被检查出，所以二代测序技术可以提供更高的识别精度。然而，cfDNA的半衰期较短，使得病原体系列数与疾病发生之间存在着密切的关联，因而，抗微生物疗法或许会对测序结论产生重大影响。