SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
贺兰山东麓老葡萄园卷叶病田间
危害调查及分子检测
黄强，张强强，顾沛雯*
（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）
摘 要：为明确贺兰山东麓老葡萄园卷叶病发生状况及感染病毒的种类，对贺兰山东麓4个种植区5个主
栽酿酒葡萄品种进行了葡萄卷叶病田间危害调查，采用RT-PCR 方法对92份样品进行6种葡萄卷叶伴随病毒GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7和GLRaV-13的检测。结果表明：西夏王酒庄葡萄园的平均发病率最高，为66.43%，病情指数为41.43；志辉源石葡萄园平均发病率最低，为5.64%，病情指数为1.89。5个品种中，‘蛇龙珠’为葡萄卷叶病的易感品种，其平均发病率高达70.47%；并且酿酒葡萄品种均易被GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3卷叶伴随病毒感染，其中GLRaV-3的平均检出率最高，为70.17%；病毒的序列比对分析表明，该地区种植的葡萄品种感染了3种卷叶伴随病毒，与来源于加拿大、匈牙利、土耳其、法国、葡萄牙、意大利、巴西、希腊、中国（辽宁）和南非地区的病毒基因序列同源率较高，为95%以上。本研究为贺兰山东麓地区有效控制酿酒葡萄卷叶
病的发生，减少葡萄病毒病的传播和蔓延，提供理论依据。
关键词：贺兰山东麓；酿酒葡萄；葡萄卷叶病；葡萄卷叶伴随病毒；RT-PCR 检测中图分类号：S436.631 文献标志码：A DOI ：10.13414/jki.zwpp.2023.04.006
收稿日期：2022-10-07
基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFD1002502）
作者简介：黄强（1999—），研究方向为资源利用与植物保护。E-mail:****************
*通信作者：顾沛雯（1969—），教授，博士生导师，研究方向为植物病理学。E-mail:********************
Field Hazard Investigation and Molecular Detection of Grapevine Leafroll
Disease in Old Vineyards in the Eastern Foot of Helan Mountains
HUANG Qiang, ZHANG Qiangqiang, GU Peiwen*
(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)
2023(4): 40-48
Abstract: In order to clarify the occurrence of grapevine leafroll disease and the types of viruses in old vineyards
in the eastern foot of Helan Mountains, five major wine grape varieties cultivated in four growing areas of Helan Mountains were investigated for field hazard of grapevine leafroll disease. RT-PCR was used to detect GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-7 and GLRaV-13, six kinds of Grapevine leafroll-associated viruses in ninety-two samples. The results showed that the incidence of Xixiawang vineyard was the highest (66.43%), and the disease index was 41.43. The incidence of Zhihui vineyard was the lowest (5.64%), and the disease index was 1.89. 'Cabernet Gernischt' grapevine was a susceptible variety of grape leafroll disease, and its average incidence reached 70.47%. Wine grape varieties were susceptible to three kinds of Grapevine leafroll-associated viruses infection, namely GLRaV-1, GLRaV-2 and GLRaV-3, among which GLRaV-3 has the highest detection rate. The sequence alignment analysis of viruses showed that the wine grape varieties grown in this region were infected by three Grapevine leafroll-associated viruses, which from different regions, and these Grapevine leafroll-associated viruses
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葡萄病毒病是制约葡萄产业健康发展的主要因素，葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease，GLD）是造成严重经济损失的系统性病毒病害之一[1]。在我国，卷叶病分布较广，凡有葡萄栽培的地区都有该病的存在，其中北京、河北、天津、山东和宁夏发生较重[2]。该病病原是葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated viruses，GLRaVs）。迄今为止，全世界已报道了6种葡萄卷叶伴随病毒，分别为GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-4的变种GLRaV-5、GLRaV-6、GLRaV-9、GLRaV-Pr、GLRaV-De、GLRaV-Car）、GLRaV-7和GLRaV-13，均属于长线病毒科（Closterovoridae）[3-5]。
葡萄卷叶病的典型症状是葡萄树体感染病毒后，下部叶片先表现症状，叶片向下翻卷，并逐渐向上部叶片扩展，因卷缩而发脆。Maree等[6]研究发现，葡萄植株感染卷叶伴随病毒后，树势会受到严重影响，植株寿命显著缩短。徐美隆等[7]研究发现，葡萄植株在感染卷叶伴随病毒后，其叶片组织中的叶绿素含量减少，感病植株光合速率明显减弱。刘万好等[8]通过检测感染卷叶病的‘蛇龙珠’葡萄成熟果实理化指标发现，其还原糖含量比正常植株最多降低24.05%，含酸量是正常植株的1.4倍。目前，葡萄卷叶病无法通过化学药剂进行有效控制，防治方法主要通过栽植脱毒苗木。随着葡萄种植年限的增加，老园感病率和感病程度正逐年提高，因此建立高效准确的检测方法，是早期诊断和防治葡萄卷叶病的关键措施。
近几年，常用于检测GLRaVs的方法有：生物学方法、血清学方法、免疫电镜、双链RNA分析、标记
探针杂交和RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）等[9]，其中，生产实际环节中应用最为广泛的是RT-PCR技术。李晨等[10]利用RT-PCR方法对6个葡萄品种进行了14种葡萄病毒的检测，共检测出13种葡萄病毒，其中分布较广的为沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄斑点病毒（G F k V）和葡萄卷叶伴随病毒3（GLRaV-3）。吕苗苗等[11]采用RT-PCR方法，对贺兰山东麓地区40份样品进行GLRaV-1～GLRaV-5这5种葡萄卷叶伴随病毒的检测，共检出3种病毒类型，其中GLRaV-3的检出率最高，为87.5%。葡萄卷叶伴随病毒为RNA病毒，由于其在自我复制过程中缺乏矫正机制，极易发生变异[12]，顾沛雯等[13]对宁夏地区的酿酒葡萄进行了RT-PCR检测，经基因同源性比对研究，发现GLRaV-3宁夏分离物的CP基因可能存在分子变异。且有大量研究表明葡萄病毒可以通过介体昆虫如粉虱、叶蝉和蚜虫等传播，进而进一步扩大危害范围，因此有必要重新对不同地区酿酒葡萄卷叶病进行全面的调查和检测，这对指导该地区葡萄卷叶病的早期监测和防控具有重要意义。
本研究通过对贺兰山东麓地区老葡萄园酿酒葡萄卷叶病的调查及检测，旨在明确贺兰山东麓地区酿酒葡萄卷叶伴随病毒的携带状况，并对目前当地主栽酿酒葡萄品种健康状况进行综合评估，为宁夏酿酒葡萄病毒病的早期诊断和建立葡萄脱毒苗繁育技术体系提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料
供试品种为‘蛇龙珠’‘美乐’‘赤霞珠’‘贵人香’和‘霞多丽’5个品种，树龄均在10年以上。上述供试品种分别采自贺兰山东麓4个种植区代表性葡萄园，其中石嘴山种植区选择贺东庄园，银川种植区选择新牛酒庄和志辉源石酒庄，永宁种植区选择立兰酒庄和西夏王酒庄，青铜峡种植区选择西鸽酒庄。
1.1.2 主要仪器与试剂
Simpli Nano超微量分光光度计（GE Healthcare 公司，美国）；C200全自动凝胶成像仪（A z u r e Biosystems 公司，美国）；T100TM PCR仪（Bio
had a high homology rate of more than 95% with viral gene sequences originating in Canada, Hungary, Turkey, France, Portugal, Italy, Brazil, Greece, China (Liaoning) and South Africa. This study provides a theoretical basis for effectively controlling the occurrence of Grapevine leafroll disease and reducing the spread of Grapevine virus disease in the eastern foot of Helan Mountains.
Key words: the eastern foot of Helan Mountains; wine grape; grapevine leafroll disease; grapevine leafroll-associated viruses; detection of RT-PCR
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rad 公司，美国）；DYY-6C 电泳仪（北京六一厂，中国）；3K15冷冻离心机（Sigma 公司，美国）； LE204E 电子分析天平（Mettler-toledo 公司，瑞士）。
RNA 提取试剂盒（Kit R6827，Omeg 公司，美国）反转录试剂盒（EasyScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （One-Step gDNA Removal ），北京全式金生物有限公司，中国）。
1.2 方法
1.2.1 田间危害调查
2021年6—9月，对贺兰山东麓4个种植区6个酒庄的5个主栽酿酒葡萄品种进行葡萄卷叶病的田间自然发病情况调查，并记录其危害症状。每个葡萄园每品种选择一块样地，每样地随机选取10行，每行随机选取3个小区，每个小区范围是2个架杆间的葡萄植株，区间内进行逐行逐株调查发病情况。按吕苗苗等[11]的方法对植株发病严重程度进行分级，计算发病率和病情指数。
严重度按5级标准进行分级：0-无症状；1-仅在枝条基部老叶上有轻微卷叶病症状；2-植株有1/3以下的叶片有卷叶病的症状；3-植株上有1/3～1/2的叶片有卷叶病症状；4-植株上有1/2以上的叶片有卷叶病症状[11]。
发病率（%）=(病株数/调查总株数)×100病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
酿酒葡萄1.2.2 RT-PCR 样品采集方法
每个品种在设置的小区内，随机选择单株进行叶片采集。具体操作为每单株分上、中、下部各取1片叶，迅速用锡箔纸包好，作为一个样品。标记好采集地点、品种等信息，置于液氮罐中，带回实验室置于﹣80 ℃冰箱中保存，备用。共计92份样品。
1.2.3 RNA 提取及cDNA 的合成和PCR 检测
在样品中加入液氮并迅速研磨至粉末状，转移100 mg 粉末到1.5 mL 的离心管中，使用Plant RNA Kit R6827试剂盒进行总RNA 的提取。将提取出的总RNA 使用EasyScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR （One-Step gDNA Removal ）试剂盒反转录成cDNA ，采用表1中的特异性引物对样品中的病毒进行检测。PCR 扩增反应体系（25 μL ）：Max Taq 酶12 μL ，上、下游引物各1 μL ， RNase-free Water 9 μL ，cDNA 2 μL ；PCR 扩增条件：94 ℃ 3 min ；94 ℃ 3 min ，55 ℃ 45 s ，72 ℃ 1 min ，35个循环；72 ℃ 10 min 。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物。PCR 产物由测序公司进行测序。
1.2.4 数据处理
利用Microsoft Excel 2019与SPSS 20.0对92份样品检测结果进行分析整理，计算发病率和病情指数。从GenBank 中获得3种卷叶伴随病毒不同地理来源的基因序列（表2），利用Mega 7.0软件对测序结果进行多重
表1 RT-PCR 所用引物
Table 1 Primers used in RT-PCR
病毒Virus 引物Primer 引物序列 (5'-3') Primer sequence (5'-3')扩增片段大小Amplicon size (bp)
引用文献
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比对，分析不同毒株分离物间的核酸序列相似性并构建系统发育进化树。
2 结果与分析
2.1 老葡萄园卷叶病的田间症状
贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病于7月上旬开始，田间陆续可见发病症状，前期症状表现为植株叶片叶缘
轻微反卷（图1 A ）。不同酿酒葡萄品种感染卷叶伴随病毒后，表现出的症状不同。随着葡萄生长，红品种感病植株叶片开始出现大小不等的红斑，叶片反卷幅度加重，叶肉开始逐渐加厚。葡萄成熟以后，感病症状最为明显，表现为植株叶片各红斑连接面积扩大，叶脉保持绿，叶片反卷皱缩（图1 B ）。白品种感病植株前期症状与红品种相同，但后期叶片向后反卷并未变红，叶片组织叶绿素含量变低，表现出褪绿黄化的症状（图1 C ）。红和白品种感染卷叶伴随病毒后，植株果实发育不良，果粒变小，着不明显（图1 D ）。
2.2 老葡萄园酿酒葡萄卷叶病感病状况2.2.1 不同种植地区发病情况差异
由表3可知，永宁种植区的发病程度最重，其次是青铜峡种植区，银川种植区发病程度最轻。在4个种植区的6个酒庄葡萄园中，西夏王酒庄葡萄园发病最严重，平均发病率和病情指数显著高于其他酒庄，分别为66.43%和41.43；其次是新牛酒庄葡萄园，平均发病率和病情指数分别为42.72%和22.1。志辉源石葡萄园发病程度最轻，平均发病率和病情指数显著低于其他酒庄的葡萄园，分别为5.64%和1.89。说明贺兰山东麓不同种植地区葡萄卷叶病的发病率与发病程度有很明显的差异。
2.2.2 不同品种间发病情况差异
由表4可知，不同品种的发病率和发病程度各有差异。其中‘蛇龙珠’发病最为严重，其平均发病率和病情指数都显著高于其它品种，分别为70.47%和43.32。‘美乐’次之，其平均发病率和病情指数分别为37.67%和20.59；‘霞多丽’发病程度最轻，其平均发病率和病情指数分别为20.62%和9.16，显著低于其他品种。说明‘蛇龙珠’和‘美乐’属卷叶病易感品种。
2.3 酿酒葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR 检测
2.3.1 RT-PCR 检测结果
92份样品中检测到3种卷叶伴随病毒。由表5可知，分别为GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3，其中GLRaV-3的平均检出率最高，为70.17%。5个品种均检测到GLRaV-1和GLRaV-3。‘蛇龙珠’中GLRaV-1平均检出率最高，为75.00%；其次是‘美乐’，为
表2 用于构建系统发育树的参比序列
Table 2 Reference sequences used to construct phylogenetic trees
病毒 Virus
登录号 Login ID 来源 Origin GLRaV-1
MH807217加拿大MF677861
匈牙利MH807220加拿大JQ023131法国MG925331法国KU362239土耳其GLRaV-2
KM012097
葡萄牙GU457406美国KP337395中国辽宁DQ314603意大利GLRaV-3
KJ704369巴西MT432385意大利LR215339德国KC477138
中国北京KX499444巴西EU344894智利JQ655295南非HQ401015葡萄牙HQ401018
葡萄牙
注：A. 酿酒葡萄卷叶病前期症状；B. 红品种卷叶病症状；
C. 白品种卷叶病症状；
D. 卷叶病植株果实症状
Note ：A. Pre-symptoms of grapevine leafroll disease of wine grape; B. Grapevine leafroll-associate
d disease symptoms of red varieties; C. Grapevine leafroll-associated disease symptoms of white varieties; D. Grapevine leafroll-associated disease symptoms of wine grape fruit
图1 老葡萄园酿酒葡萄品种卷叶病症状
Figure 1 Symptoms of leafroll-associated disease of
wine grape varieties
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66.67%；‘贵人香’和‘霞多丽’GLRaV-1的检出率最低，均为50.00%。‘赤霞珠’‘美乐’和‘贵人香’均检测到了GLRaV-2，其中‘贵人香’GLRaV-2的检出率最高，为41.67%；其次是‘赤霞珠’，检出率为25.00%；‘美乐’GLRaV-2的检出率最低，为16.67%。‘蛇龙珠’GLRaV-3的检出率最高，为83.33%；其次是‘赤霞珠’，为79.17%；‘霞多丽’的检出率最低，为55.00%。此外，5个品种GLRaV-3的检出率均大于50.00%。
在5个酿酒葡萄品种中发现，‘蛇龙珠’和‘霞多丽’两品种存在二重复合侵染现象，其中‘蛇龙珠’二重复合侵染率最高，为83.33%；‘贵人香’‘美乐’和‘赤霞珠’3个品种存在三重复合侵染现象，其中‘贵人香’的三重复合侵染率最高，为33.33%；‘赤霞珠’三重复合侵染率最低，为16.67%。综合来看，‘蛇龙珠’GLRa
Vs的检出率是5个品种中最高的，即在所有调查的品种中，‘蛇龙珠’是卷叶伴随病毒主要侵害的酿酒葡萄品种。
2.3.2 RT-PCR产物测序结果分析
92份样品中，共获得了12个不同来源的GLRaV-1阳性分离物，由图3所示。经序列比对分析发现，样品新牛-蛇龙珠、西夏王-蛇龙珠、西鸽-霞多丽、西夏王-赤霞珠、西鸽-赤霞珠、志辉-美乐、贺东-美乐，与样品西鸽-蛇龙珠分离的毒株序列相似，聚在了同一分支，而上述8个样品与样品新牛-美乐分离的毒株序列相似，聚在了同一分支，它们与来自加拿大的GLRaV-1 HSP基因分离物（登录号：MH807217）相似度高，同源率为98.6%；样品志辉-贵人香分离的毒株与来自加拿大的另一种GLRaV-1 HSP基因分离
表3 贺兰山东麓不同种植区老葡萄园酿酒葡萄卷叶病田间自然发病情况
Table 3 Natural incidence investigation in different planting areas of old vineyard with grapevine leafroll-associated disease
in the east foot of Helan Mountains
葡萄园Vineyard
品种
Varieties
调查株数
Investigate number
发病率
Incidence (%)
平均发病率
Average incidence (%)
病情指数
Disease index
平均病情指数
Average disease index
贺东庄园Hedong winery 赤霞珠17542.29
34.24b
26.43
19.26b 美乐17143.8623.98
霞多丽19316.587.38
新牛酒庄Xinniu winery 赤霞珠23336.05
42.72b
24.03
22.10b 美乐20742.0314.37
蛇龙珠22965.9440.17
霞多丽19431.9610.57
贵人香22637.6121.35
志辉酒庄Zhihui winey 赤霞珠224 5.80
5.64c
2.12
1.89c 美乐201 3.48 1.37
霞多丽219 5.02 1.60
贵人香1948.25 2.45
西夏王酒庄Xixiawang winery 赤霞珠21959.82
66.43a
38.36
41.43a 美乐20861.5440.63
蛇龙珠21377.9345.31
立兰酒庄Lilan winery 赤霞珠22422.77
27.94b
10.94
13.82bc 美乐20531.7115.61
霞多丽19129.3214.92
西鸽酒庄Xige winery 赤霞珠21421.96
35.92b
15.77
22.65b 美乐21243.4027.59
蛇龙珠23167.5344.48
霞多丽20320.2011.33
贵人香21526.5114.07
注：不同小写字母表示显著性差异（P<0.05），下同
Note：Different letters mean significant difference at 5% level, the same below
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