华南师范大学硕士学位论文玫瑰鲜花抗氧化能力及其活性成份的研究姓名:曾佑炜申请学位级别:硕士专业:植物学指导教师:彭永宏20040601 #南师范人学硕l…学位论文摘要我国鲜花资源丰富,花卉的食用和药用在我国有悠久的历史。花卉中许多具有抗氧化作用与保健功效的活性成份可以补充人们的膳食,开发和利用天然抗氧化活性物质已成为人们关注的热点。通过对45种鲜花DPPH…、…OH、O‟;清除能力的比较,发现红玫瑰花对3种自由基的清除能力较强,不同花卉粗提液对DPPH…的清除能力与多酚含量呈极显著正相关(F0.880),表明多酚可能是鲜花中主要的抗氧化物质,1.00mg红玫瑰鲜花对DPPH‟的清除能力相当于18.74ugVe。通过对玫瑰花抗氧化能力的研究表明:(1)玫瑰花不同品种之间花蕾和成花对3种自由基的清除能力与多酚含量都呈极显著正相关(p<0.01),比较结果为红品种的抗氧化能力普遍强于金黄和白品种;(2)不同发育时期的玫瑰花随开放程度的增加对3种自由基的清除能力、多酚和黄酮含量都呈下降趋势,即在花蕾期表现较高水平,但每朵鲜花的平均鲜重和平均多酚含量在第6期最高;(3)经短期贮藏后,瓶插玫瑰花的多酚、黄酮和Vc含量初期呈上升趋势,对3种自由基的清除能力也相应增强。40C贮藏更有利于保持抗氧化物质的活性,但4d后开始下降;(4)不同溶剂的提取液中,热水提取液对DPPH…的清除能力强于丙酮、水和乙酸乙酯等溶剂的超声波提取液;(5)随着提取温度升高,提取液的抗氧化能力逐渐增强,但100℃提取30min后抗氧化能力和多酚含量并无显著变化(p>O.05);(6)在一定的范围内,粗提液的抗氧化能力与加入剂量呈线性变化(r=0.991:3,=15.792x+14.745);(7)提取液在pH=5时抗氧化能力最好,与其他pH条件达差
异显著水平(P<0.05),碱性条件会减弱或破坏提取液的抗氧化能力。用气相谱/质谱分析玫瑰花的乙醇提取物,检测出18种物质,其中带“一OH‟‟羟基团物质总量达到75.014%,用四种不同基质分离玫瑰花热水提取液,发现采用CM一52阳离子交换纤维素柱,水一乙醇梯度洗脱,对粗提液的分离效果最好,并可起到浓缩作用。4℃保存CM.52分离的活性物质,结果120d后仍然保持很强的抗氧化能力。关健词玫瑰花,自由基,抗氧化,活性成份,分离——墨塾壁垄堕墼些堂尘垄.鉴适丝堕丝塑竺塞AbstractTherearegoodresourcesoffreshflowers,andmanyofthemarewidelyusedastraditionalmedicinesandfoodproductsinChina.Theantioxidantcomponentswithactivitiesorspecifiedhealthusearerichinflowersandcanactasdietarysupplement.Itbecomesahotfieldtoexploitandutilizenaturalantioxidantresource.Theantioxidanteffectsin45kindsoffreshflowersobtainedinthisstudywereevaluatedinthreeways:usingl,1一diphenyl-2·picrylhydrazyl(DPPH)radicalscavengingactivity,hydroxylradical
scavengingactivityandsuperoxidant—dismutase(SOD)一likeactivity.Theresultswereshowedtherewassignificantcorrelation-ship(p<0.01)betweenDPPHradicalscavengingactivitiesandpolyphenolics.Thisindicatedthatpolyphenolicsshouldactasactivecomponentsinflowers.Carminerosewasagoodscavengertothethreekindsoffreeradicalsandthescavengingactivitiesof1.OOmgfreshroseflowersonDPPH+wasequalto
18.74BgVc.Severaleffectfactorsweretestedasfollows:(1)Therewassignificantcorrelation—ship(p<0.01)betweenthreeradicalscavengingactivities
ofavarietyofrosebutsandflowers;(2)Thecontentsofpolyphenolicsandflavonoidsindifferentdevelopmentalstageweredecreased,aswellasthescave
ngingactivitiestothethreeradicals.Butthemeanweightofeachfreshflowerwashi曲estindevelopmentalstage6;(3)Thescavengingactivitiestothethreeradicalscavengingactivitiesincreasedfollowingtheincreasingcontentsof
polyphenolics,flavonoidsandVcatthebeginningofshort-termstorage.Low-temperaturetreatmentwasaneffectivemeasureforpreservingantioxidants;(4)Theresultsprovedthatboilingwaterwasthebestsolventforextractingmaincomponentsofrose,comparedwithdifferentsolventssuchasacetone,waterandethylacetateontheeffectofultrasound;(5)Thescavengingactivitiesofaqueousextractsinereasedwhenincreasing
itsextractingtemperature,Bothscavengingactivitiesandthecontentsofpolyphenolicshadnosigni
ficantdifference(P>0.05)afterextractingfor30minat100℃;(6)Theeffectsofvaripusconcent
rationofextractsontheDPPH…wereexamined,andtherelationshipbetween6毕南师范,I:=学坝士学位论迁concentrationandscavengingactivitieshadalineardose—responserelationship(r=0.991;Y215.792x+14.745);(7)pH5wasconsideredtobethebestextractingpHvalues.whichhadasignificantdifferenceat5%levelwithothersandthescavengingactivitieswerelimitedinalkalineCOnditions.18compoundshadbeenidentifiedbygaschromatography/massspectrometry,amongwhich75.014percentageshadhydroxylgroup.TheaqueousextractswerefractionatedonsephadexG一100,polyamide,sephadexLH一20andCM一52columnsusingwater/ethanolasthesolvent.TheresultsshowedfractionsseparatedfromCM一52column
possessedaremarkableantioxidantactivitycompounds,whichstillexistedhighscavengingactivitiesafter120daysin4”Cstorage.Keywordsrose;freeradicals;antioxidant;activecomponents;separation7玫瑰蛘花抗氧化能』及其活眭成份的研究第一章花卉的抗氧化作用及保健功效(综述)自1955年Harrnan创立自由基衰老学说以来…,自由基生命科学的研究|_il益深入。研究表明自由基可能与许多年龄相关的疾病如肿瘤、衰老、心脑血管疾病、免疫力下降、休克、炎症、辐射损伤等的发生发展密切相关〔21。各种各样的外源性和内源性活性氧自由基在一定的外界条件下,时时刻刻产生并引起脂质过氧化(LPO),并导致DNA、蛋白质、细胞膜等体内大分子损伤,细胞功能衰退或丧失等一系列反应,引起许多生物学、生理学及病理学过程发生各种各样的变化,参与信息传导、基因表达、细胞凋亡等各种生命过程【3】。环境污染、紫外辐射、抽烟、都会增加人体内自由基的数量,一旦氧自由基的生成过多,或清除氧自由基的能力减弱,便会引起细胞损伤,即氧化应激(OxidativeStress)。而现代食品加工工艺往往导致食品营养功能降低,这些都需要增加外源抗氧化剂。抗氧化剂被人体吸收后能调节人体机能,阻断氧自由基的生成或清除氧自由基〔41,从而保护细胞,因此,寻有效的抗氧化剂对疾病的和人体保健非常有益。现有的抗氧化剂,如Vc、VE、茶多酚、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)及没食子酸内酯(PG)等,绝大多数为化学合成产品。在天然、营养、回归大自然的热
潮中,人们越来越趋向尽可能使用天然抗氧化活性物质。近几年来,国内从红参、当归、生地、酸枣仁、阿魏等中草药中提取了许多抗氧化物质。在日本,有保健作用的天然抗氧
化剂,如绿茶萃取物、甘草萃取物、迷迭香萃取物的市场日益扩大【5 ̄7】。欧洲16世纪开始有食用花卉的习俗,并近来越来越受到的人们的喜爱【8】,我国鲜花资源丰富,食用花卉是我国传统饮食文化的一大特,开发和利用花卉特别是花器官已成为人们关注的新热点,具有理论价值与商业前景。1.1花卉的抗氧化与保健功效1.1.1花卉营养成分根据初步统计,食用花卉共303种,包括74个科,178个属,其中有70种广泛分布或栽培91。花卉中含有人体所需要的22种氨基酸,脂类,糖类,VA、华南师范大学硕卜学位论文VB、Vc、VE、Vpp等维生素,铁、锌、硒、钙、镁等矿物质,以及蛋白酶、多酚、黄酮类化合物等生物活性物质四。1.1.2花卉提取物的抗氧化作用与保健功效我国传统中医有很多花卉药用功能的记载,如桃花可以利水、活血、通便:蔷薇花能清暑、和胃、止血;鸡蛋花可以去湿、除热、润肺、解毒四。现代科学研究表明,花卉除了供给人体各种营养成分外,还能清除人体多余的自由基,调节机体组织与细胞生长,修复细胞损伤。花卉中富含维生素,如有些玫瑰中Vc的含量是柠檬的50倍。Vc是人体免疫系统所必需的维生素,Vc缺乏能使免疫功能降低,Vc抗氧化法对于减少心脏移植手术后的动脉硬化以及增加肾、肺、肝的功能有明显作用〔1引。vE可作为结构脂蛋白或酶的载脂成分保护剂,可降低白细胞DNA的损伤及抑制大鼠肝细胞的脂质体过氧化【1”。许申鸿等研究了不同鲜花水提取液对
羟自由基与DPPH(I,1.二苯基苦基苯肼)自由基的清除作用,并与天然抗氧化剂茶多酚及合成抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)进行了比较,认为花卉粗提物能清除自由基,一定量的天竺葵粗提液对自由基的清除活性甚至高于茶多酚和TBHQ〔14,151。白杜鹃花蕾的粗提液有很强的抗Fe2+诱发的脂质过氧化及抗H202诱导的细胞溶血活性【l”。月季花粗提物具有阻断亚油酸、猪油的脂质过氧化作用,O.1%的月季花粗提物对亚油酸及猪油的抗氧化效果优于O.02%的茶多酚〔】7J。刺山柑(CapparisspinosaL)花蕾的甲醇提取液有很好的抗Fd+诱导的脂质体过氧化及清除DPPH自由基的能力,lmg/mL的抗氧化能力比芦丁(rutin)强,与BHT相当【18】。玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)干花中提取的原儿茶酸具有抗氧化和抗肿瘤作用”91。菊花提取物可以提高小鼠的抗疲劳能力,明显降低大鼠血清中的胆固醇120‟2”,菊花(DendranthemamorifolizmO提取的醇类物质有明显抗肿瘤效果吲,其中的矢车菊素(eyaniding)对自由基的清除能力是Vc的20倍,vE的50倍,并能加强Vc的抗氧化能力。鲜花的花素成分是黄酮类的一种,被人体吸收后能明显清除体内自由基,延缓衰老,防止和减少心m管疾病及癌症的发生f23】。用甲醇一水作溶剂,从鹰爪豆花(SpartiumjunceumL.)中提取的黄酮类物质槲皮素和4一B糖苷槲皮素有很强的抗氧化能力,并可用来治胃溃疡〔24,25〕,Cichewicz用己烷、乙酸乙酯、甲醇从黄花菜(Hemerocallisspp-)9玫瑰鲜花抗氧化能力及虬活性成份的研究花中提取出一种新的抗氧化物质萘苷(stellademl),其抑制LLⅣ磷脂过
氧化的活性比TBHQ、BHA、B}rr和VE都强〔26】。从丁香花蕾中提取得到的香昧抗氧化物质丁子香酚和乙酸丁子香酚酯可以抑制乙醛及鳕鱼肝油的氧化…271。所以,花卉中提取的多酚和黄酮类物质除了具抗氧化清除自由基的功能外,还能抗菌、预防心脑血管疾病、
延缓人体衰老、降低血清及肝脏中的脂肪含量、抗变异肿瘤、预防和冠心病、癌症及过敏症…28珈1。在众多的抗氧化剂中,很多抗氧化剂都有协同作用,从而使抗氧化能力大大增强。1.2花卉的抗氧化活性成分及其作用机理活性氧在体内主要以超氧阴离子(0‟i),羟自由基(…OH),单线态氧(102),脂自由基和过氧亚硝基(ON00一)等形式存在,它们是人体新陈代谢的副产物。花卉中活性氧的清除系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等酶类及谷胱甘肽(GsH)、维生素(包括在vA、vE、vc和vK)、13.胡萝h素、部分氨基酸(蛋氨酸、精氨酸、组氨酸和半胱氨酸)、微量元素(锌和硒等)、酚类及黄酮类等非酶类物质。它们可以对自由基起到预防(prevemion)(_}tl转铁蛋白、铁蛋白和白蛋白等);转移或中和自由基上多余电子(enzymaticdiversion/neutralisaion)(如SOD、CAT和GSH—Px等);清除(scavenging)(如VE、Vc、尿酸、胆红素、谷胱甘肽和多酚类物质等);淬‟灭(quenching)(如VE和B一胡萝h素等)作用。SOD是抗氧化应激酶系中的重要成员,它与生物体内的解毒作用有关131】,催化如下反应:2o.;+2H+旦H202
不一定需要糖和玫瑰(1)SOD把对细胞破坏力极强的超氧阴离子O{歧化成过氧化氢和氧气,过氧化氢随后经体内的CAT或POD分解或利用掉,从而解除0.-的毒性。谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸组成的小肽,还原型谷胱H一肽分子中含有活泼的巯基(一SH)。人体中红细胞在代谢过程中经常产——一望塑塑焦叁兰塑!二兰些堡墨生少量的H202,在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH.Px)的作用下,把H202还原为H20132】oGSH‟PxH202+2GSH———‟2H20+GSSG(2)ROOH+2GSH——卜GSH.P。ROH(醇)+GssG+H20(3)同时,谷胱甘肽可直接作用于自由基,使之转变为稳定的分子。2GSH-}-2R”——+GSSR+2RH(4)Vc是众多抗氧化剂中研究最深入并已广为接受的一种抗氧化剂,它有很强的自由基清除能力。VE是体内抗氧化剂,同时又是一种有效的免疫调节剂,vE可抑制机体中过氧化物和环氧化物自由基的产生,清除体内过多的活性氧,吸收自由基的电子或能量,维持细胞膜的稳定性。同时,VE还可能通过谷胱甘肽过氧化物酶与微量元素硒产生协同作用。微量元素中,硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)、硫氧还原酶(thioredoxinreductase)中的重要元素,能影响机体的免疫功能,硒的生物学意义主要体现在硒蛋白和硒酶的重要生理功能上随Ⅻ;锌、铜、锰参与构成超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD,Mn.SOD),诱导体内硫蛋白的产生而抵制自由基的损害【35】。氨基酸普遍具有清除0.-和。OH的能力闭,精氨酸还能扩张血管,是缓解冠心病和脑血管疾病的活性一氧化氮自由基(内皮细胞松驰因子)的前体【37】。多酚类物质因为酚羟基的还原性,与抗氧化直接相关,近年来越来越受到关注138〕。
除了具抗氧化清除自由基的功能外,多酚还能抗菌、预防心脑血管疾病、延缓人体衰老、降低血清及肝脏中的脂肪含量及抗变异肿瘤。黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构,其B环是抗氧化、清除自由基的主要活性部位,c3‟-OH有强烈的供氢能力,酚羟基与自由基反应生成稳定的半醌式自由基,黄酮类化合物的抗氧化能力表现为生成的新基