上海生博AAV产品手册（2017版）
一、AAV背景知识
1.1AAV概况
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，是一类无包膜的细小病毒，属于微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus)，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下，AAV病毒本身呈二十面体结构。AAV 基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA，ssDNA)，只含两个基因，Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。AAV为目前发现的基因组最简单的复制缺陷型病毒，也因此，AAV被作为病毒载体广泛应用。
FIG1 AAV的3D构象图FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成
FIG1和FIG2文献出处：Mingozzi, F. and K.A. High.Blood, 2013. 122(1): p. 23-36.
FIG3 AAV TEM图
Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.最漂亮的av
1.2AAV的ITR区
AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。ITR区富含GC(>80%)，可折叠为一个自我互补的T型发卡结构，其中的Rep蛋白结合位点(Rep binding elements，RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site，TRS)是AAV 基因组的复制起始的关键。另外ITR区还含有包装信号，是AAV整合、复制和包装所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子活性。
FIG4 AAV基因组结构图
Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.
FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)
Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.
1.3AAV的ORF
AAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Rep基因和Cap基因。左侧的ORF含Rep基因，可编码4个非结构蛋白-Rep40、Rep52、Rep68和Rep78，对AAV的复制、转录、基因组整合和包装必不可少。Rep使用p5启动子产生非剪切和剪切后的转录产物，后翻译得到分子量较大的Rep78和Rep68蛋白；p19启动子则可产生更短的非剪切和剪切后的转录产物，经翻译得到分子量较小的Rep52和Rep40蛋白。
右侧的ORF含Cap基因，可编码3个结构蛋白-VP1、VP2和VP3，Cap使用p40启动子，经剪切后产生两个转录本，较长的转录本翻译产生分子量为87KD 的VP1蛋白，较短的转录本可使用两个密码子，由非传统的ACG起始密码子起始，得到72KD的VP2蛋白，下游传统的AUG起始密码子起始，得到62KD的VP3蛋白。5个VP1、5个VP2和50个VP3蛋白共同构成AAV的病毒外壳(VP1:VP2:VP3=1:1:10)，衣壳表面由VP3、VP1的C端和VP2的C端构成，VP1和VP2的N末端位于衣壳内部。
FIG6 AAV 蛋白的编码
Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93. 1.4AAV的复制
AAV是复制缺陷型病毒，需要腺病毒(Adenovirus，Adv)或疱疹病毒(Herpesvirus)等辅助病毒提供DNA聚合酶和解旋酶，参与复制。通常情况下，我们将用目的启动子和基因取代AAV的基因组本身的rep和cap基因，得到重组AAV(recombinant AAV，rAAV)的基因组质粒。在体外AAV包装系统中，除去rAAV质粒，还需要一个含有rep和cap基因的外壳质粒、一个含E2a、E4和VAI RNA基因的辅助质粒(E2a表达一个ssDNA结合蛋白质，以促进AAV DNA复制，E4编码增进mRNA装运到细胞质的蛋白质，VAI RNA基因生成一个小RNA转录物增进AAV capsid mRNA的翻译)，在辅助质粒的帮助下，ITR将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。rep和cap 基因转移后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。
FIG7 rAAV的基因组及包装
Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800. 1.5AAV的生活史
自然情况下，AAV感染细胞后，之后的过程可分为七个阶段，即：(1)AAV与受体的结合，(2)病毒颗粒的内摄，(3)囊泡的运输，(4)内涵体的脱离，(5)核转运，(6)病毒脱壳，(7)在辅助病毒存在，提供DNA聚合酶和解旋酶时，基因组DNA进行复制。但是当没有辅助病毒的存在时，AAV定向整合至19号染体(q13.4)，被称为AAVS1，仍可进行复制，但不产生或包装子代感染性病毒颗粒。而体外包装得到的rAAV感染细胞后，通常不会整合到基因组，而是串联形成附加体(类似细菌的质粒)存在于细胞核中，从而保持长期稳定的基因表达，对于终末分化的细胞，该优点特别明显。
FIG8 rAAV生活史
Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.
1.6AAV的血清型
AAV在动物体内表现为有多种血清型，这是由于AAV有多种不同的外壳蛋白，不同血清型的AAV，感染过程中使用的受体也不尽相同（表格1），因此感染的组织器官和效率也各有差异（FIG9）。
目前，在人体内发现12种AAV，AAV1-AAV12，而在非哺乳类动物体内则发现100多种的AAV血清型。现有研究所用的AAV中，AAV2、AAV3、AAV5和AAV9是从人体内分离得到的，其他血清型的AAV均为动物体内分离得到（表格1）。自然情况下，80%的AAV感染都是AAV2感染，而AAV2也是最早被分离并应用最广泛的血清型，但是AAV2感染范围较窄，而人们也在不断研发新的AAV血清型，AAAV2已被其他血清型逐步替代。