第12卷第6期2021年3月
Vol.12
Mar.2021黑龙江科学
HEILONGJIANG SCIENCE
利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠CCKAR敲除载体
刘惊涛，李知宗，林显光，陈恒玲
(中南民族大学生物医学工程学院/脑认知国家民委重点实验室/
医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉430074)
摘要：CCKAR在许多疾病的发病机理中具有重要作用。为研究其分子机制，选择利用CRISPR/Cas9基因编辑体系，构建K0载体。根据CCKAR基因序列设计敲除靶点，通过质粒单酶切、Oligo退火、连接，成功构建了CCKAR的敲除载体。该质粒的成功构建可为将来CCKAR基因的功能研究提供重要的基础。
关键词：CRISPR/Cas9；CCKAR；敲除载体
中图分类号：R361+1文献标志码：A文章编号：1674-8646(2021)06-0016-03
Construction of Mice CCKAR Knockout Carrier by CRISPR/Cas9Technology
Liu Jingtao,Li Zhizong,Lin Xianguang,Chen Hengling
(College of Biomedical Engineering,South-Central University for Nationalities/Key Laboratory of Brain Cognition, State Ethnic Affairs Commission/Hubei Key Laboratory of Medical Information Analysis
and Tumor Diagnosis and Treatment,Wuhan430074,China)
Abstract:CCKAR has important function in pathogenesis of many diseases.In order to research the molecular mechanism,the research uses CRISPR/Cas9gene compiling system,and constructs KO carrier.According to CCKAR gene sequence design,target spot is knocked out.Through plasmid single digestion,Oligo anneal and connection,the
knockout carrier of CCKAR is successfully constructed.The basis for future CCKAR genetic function research.
Key words:CRISPR/Cas9；CCKAR；Knockout carrier
1胆囊收缩素A受体与CRISPR/Cas9系统工作原理
1.1胆囊收缩素A受体
胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)由肠I细胞分泌,CCK可通过内分泌、旁分泌、自分泌和神经分泌等
多种形式调节多种细胞功能⑴。研究提示,CCK可能
与糖尿病的发病存在密切关系⑴。在胰岛中，CCK可
以通过胆囊收缩素A受体(Cholecystokinin A receptor, CCXAR)来调控胰腺中各个细胞的功能。大量事实证明，CCKAR基因与动物的日采食量和平均日增重有明
显关联。Takiguchi通过研究发现,CCKAR基因能维持
收稿日期:2020-07-19
基金项目：国家自然科学基金项目(31870771,31500996, 321201881271234,81771196)；中央高校基本科研业务
费专项基金项目(CZY19023,CZY18027,CZY17030)
作者简介：刘惊涛(1995女，学生。
通讯作者：陈恒玲(1982-)，女，博士，讲师。successful construction of plasmid can provide important
动物体内的血糖浓度⑵。胆囊收缩素A型受体基因与幻听相关⑶，胆囊收缩素A型受体与人胆道癌及胆石症易感性有一定关系⑷。
1.2CRISPR/Cas9系统工作原理
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palin­dromic repeats)被称为规律成簇间隔短回文重复序列。Cas9是CRISPR相关核酸酶，CRISPR/Cas9是最新出现的一种由gRNA指导的、利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA序列进行特异性降解。crRNA通过碱基互补配对，与tracrRNA结合，形成tracr/crRNA复合物。此复合物引导核酸酶Cas9蛋白与crRNA互补配对的序列靶位点剪切双链DNA0 CRISPR/Cas9系统由于其突变效率高、制作简单、成本低，被广泛应用于基因组的精确修饰，是一种具有广阔应用前景的基因改造分子工具[5_7]0研究使用的载体为pL-CRISPR.EFS.GFP(载体信息见ADDGENE: 57818)o
2实验部分
2.1实验材料
Bsmb I限制性核酸内切酶（美国Thermo Scientific 公司生产）、CCKAR Oligo序列（武汉Tsingke公司生产）、T4DNA连接酶（武汉淼灵生物公司生产）、pL-CRISPR.EFS.CFP（实验室提供）、5x Annealing buffer （上海Beyotime公司生产）、质粒提取试剂盒（美国OMEGA公司生产）、DH5a感受态细胞（武汉Tsingke 公司生产）、PCR仪（美国Veriti公司生产）、抗生素（中国Bioshap公司生产）、电泳槽和电泳仪（美国Bio-rad公司生产）、凝胶成像系统（英国SYNGENE公司生产）、恒温摇床（美国Thermo Scientific公司生产）。
2.2实验方法
2.2.1pL-CRISPR.EFS.GFP质粒提取
按照OMEGA质粒提取试剂盒（D6950-01）中的提取方法进行pL-CRISPR.EFS.GFP质粒的提取。2.2.2设计oligo
使用CRISPR设计工具得到guide RNA，用软件根据碱基互补配对原理得到两条Oligo DNA O实验使用的CCKAR基因的单链Oligo DNA如表1。
表1CCKAR基因的Oligo序列
Tab.1Oligo sequence of CCKAR gene
靶序列序列（5，—3，）
Oligol CACCGAAGGAATATCATGGAGTAC
01igo2AAACGTACTCCATCATATTCCTTC
2.2.3Oligo退火
将设计好的CCKAR基因的两条Oligo按照表2的退火体系进行退火，退火条件为95T,10min；95T〜45兀，每2min降1兀；45兀〜16弋，每1min降1兀。退火之后形成双链Oligo0将退火后的产物用水按照1：100进行稀释备用。
表2退火体系
Tab.2Anneal system
组分体积/g
Oligo1(100jiM)8
Oligo2(100|xM)8
5x Annealing buffer8
^h2o16
Total40
2.2.4pL-CRISPR.EFS.GFP单酶切
将提取好的质粒测浓度及纯度，根据浓度，按表3进行酶切,37兀，30min0
表3单酶切体系
Tab.3Single digestion system
组分体积
pL-CRISPR.EFS.GFP800ng
Bsmb I1jxL
10x fast buffer2pl L
Add ddj^o to20p.L
朱铁
2.2.5回收
将酶切好的质粒按OMEGA胶回收试剂盒（D2500-02）中的步骤进行回收。
2.2.6连接
将稀释好的双链Oligo产物与回收好的空载体按表4进行连接,25弋连接2h。
表4连接体系
Tab.4Connection system
组分体积/jiL
双链Oligo5
回收的空载体2
T4ligation1
10x T4ligation buffer1
dd H201
Total10
2.2.7转化
提前准备好冰盒，从-80七取出DH5a感受态细胞，置于冰上解冻。将连接产物加入感受态细胞中（体积比不低于1：10），轻弹混匀，冰浴30min0准备42T水浴锅，将冰浴好的混合液置于其中热击90s，向其中加入400piL不含抗生素的LB培养基，混合均匀，置于37七恒温摇床,180r/min,45min0将其放于离心机中离心，条件3500r/min,5min o弃400pL上清，将剩余100pX吹打混匀。将菌液均匀涂布于含抗性的LB固体培养基上,37七，倒置培养过夜。
2.  2.8挑选阳性克隆
准备好无菌50mL离心管及含氨节抗性的液体LB培养基及含单菌落的平板。取5mL培养基加入离心管中，从板子上选取几个单菌落，用无菌的小头挑取单菌落置于离心管中。
2.2.9摇菌
标号，置于摇床中，摇至菌液浑浊。
2.  2.10阳性克隆鉴定
鉴定阳性克隆所用的引物如表5所示。将浑浊的菌液按表6体系及表7的反应程序做菌液PCR鉴定0
表5菌液PCR体系
Tab.5Bacterial liquid PCR system
引物序列（5，t3，）
Test primer F TTCACCATTATCGTTTCAGACC 01igo2AAACGTACTCCATCATATTCCrrC
表6菌液PCR体系
Tab.6Bacterial liquid PCR system
组分体积/“L
10x buffer2
Ex Taq0.2
2.5Test primer F2
2.5|iM Oligo22
菌液1
2
2.5mM dNTP
双蒸水10.8
表7PCR反应程序
Tab.7PCR reaction procedure
步骤温度时间
195°C5min
295X.30s
368X.~52X.a30s
472°C30s
572°C10min
64°C00
P〜4重复进行，共36个循环，每4个循环降低2兀，退火温度将从68X将至52T
将鉴定正确的菌液送测序。
3结果
3.1空载体单酶切凝胶成像结果
提取的空载体浓度为540ng/piL.A260/280为1.85，按照表3单酶切体系进行酶切，酶切产物进行电泳，结果如图1所示，回收所需片段。
3.2菌液PCR凝胶成像结果
将挑取的单菌落菌液进行Touchdown PCR，结果如图2所示，菌液PCR可见大小约300bp条带，初步判断：挑取的五个菌落均为阳性克隆。
M1
图1M：1000Marker,1:pl-CRISPR.EFS.GFP单酶切电泳结果Fig.1M：1000Marker,l：pl-CRISPR.EFS.GFP
single digestion electrophoresis results
M12345
—318bp
图2M：2000marker;1-5：pL-CRISPR.EFS.
GFP-CCKAR不同克隆的PCR结果
Fig.2M:2000marker;1-5：pL-CRISPR.EFS.
GFP一CCKAR different clonal PCR results
3.3公司测序结果
将菌液PCR结果正确的菌液送至武汉擎科生物技术有限公司进行测序，结果显示：靶序列成功插入到pL-CRISPR.EFS.GFP（图3、4红框起来的部分）。
由公司给出的测序结果可知，检测K0载体的阳性克隆结果是准确的。
CCKARSS-2
CCKARS^-3 pL-CRISPR.EFS.GFP
36GGACGAAACACC
36GGACGAAACACC
36GGACGAAACACC
1954GGACGAAACACC
?AAGGAATATGATGGAGTACGTrTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAC
?AAGGAATATGATGGAGTACGT1TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAC
5AAGGAATATGATGGAGTACGT rTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAC
rTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAC 图3pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR测序图
Fig.3pL-CRISPER.EFS.GFP一 CCKAR sequencing picture
图4pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR测序峰图
Fig.4pL-CRISPER.EFS.GFP一CCKAR sequencing peak figure
（下转第22页）
表5前25个优秀产品名称比例分配情况
Tab.5Proportional distribution of previous25excellent product names
product title percent
Samsung counter top microwave16% ge profile pvm1790stainless steel…8%
pem31smss ge profile spacemaker---8%
danby0.7cu.ft countertop microwave20%
sharp microwave drawer oven12%
others36%
4结语
选用亚马逊平台微波炉产品的在线评论数据，通过PMI算法对文本情感倾向进行自然语言处理，将评论情感划分等级，从而将其量化。采用TOPSIS综合评价得到该微波炉的最优产品系列，其结果作为度量值能较为精确地反映产品口碑。主要得到了以下结论：通过PMI算法对文本感情进行分析可以实现对评论文本的量化过程。根据客户购买时的不同情况，将客户分为三类体计算评价模型的权重，有利于评
(上接第18页)
4讨论
CCKAR是一种G蛋白偶联受体，可以被CCK激活。肥胖是2型糖尿病的主要诱发因素，CCK通过CCKAR的介导对中枢系统的摄食、饱感具有调节作用⑼。CCKAR基因的功能丧失可能在肥胖小鼠中诱发糖尿病。研究发现，具有Otsuka Long-Evans To­kushima fatty(OLETF)的大鼠是天生的CCKAR基因敲除型大鼠，而OLETF的特征就是高血糖症、高胰岛素血症和肥胖⑴。理解不同CCKAR激活的上游及下游信号通路调控胰腺细胞的其他性能，可用于识别有偏好的CCKAR配体，为以后开发新的抗糖尿病药物提供帮助。
基于Crispr/cas9系统的特殊性，即插入片段在20bp左右，目的片段PCR扩增鉴定阳性克隆并不可行。在此实验鉴定中，设计正向引物位于BsmB I酶切位点的上游300bp处、反向引物是构建载体的Oligo2，当为阳性克隆时，可以扩增一个约300bp的带，当为阴性克隆时无法扩增。利用此技术，成功构建了CCK-AR基因的敲除载体，相比于传统构建载体方法更省时省力。
在基因工程中，基因表达载体的构建是一个非常重要的实验步骤。实验可以通过载体将靶序列转运到真核细胞中并将细胞基因组中的靶序列进行基因编辑，用到的载体含有GFP标签，将构建好的载体转染价模型的真实性。建立优秀产品名称模型，利用Spsis 的综合评价方法选出danby0.untertop mi­crowave，该产品为Amazon平台中微波炉评价最好的微波炉产品系列名称之一。
该模型针对于线上产品销售数据分析，对选择优秀产品系列有较好的应用与推广意义。
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到细胞中，其是否表达可很明显地看出。新构建的K0载体可以方便后续验证设计出的sgRNA的活性及是否脱靶，如果将其包装成慢病毒非常适合常规细胞系的建立。
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