文章篇号:1007-2764(2006)03-0251-090
吴炜亮，吴国杰，梁道双 杨帆
(广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006)
摘要：血管紧张素转化酶（ACE）在人体血压调节方面起着重要的生理作用。近年来天然食品来源的ACE抑制肽已成为生物活性肽研究领域的热点。ACE抑制肽通过抑制ACE活性起降血压作用。文章综述了ACE抑制肽的作用机制、结构特点、评价方法和研究进展。
关键词：ACE；ACE抑制肽；食品蛋白质
The Physiological Function and Research Progress of
Angiotensin-I-converting Enzyme Inhibitory Petides
Wu Wei-liang, Wu Guo-jie, Liang Dao-shuang, Y ang Fan
(Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou5
10006, China) Abstract: Angiotensin-I-converting enzyme (ACE) plays an important physiological function in the blood pressure of people. In the recent years, Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory petides from natural food has been the hotspot in the physiological bioactive peptides. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides let the blood pressure down by restraining the bioactive of the Angiotensin-I-converting enzyme. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides effective principle, structure characteristic, estimate method and research progress have been review in this thesis.
Keywords: Angiotensin-I-converting enzyme; Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides; Food protein
生物活性肽是自然界中种类极多，功能复杂的一类化合物。这些化合物从简单的二肽到复杂的线性、环形结构，有的氨基酸残基还进一步糖基化、磷酸化、乙酰化，多肽结构的复杂性和多样性反映了活性肽对细胞生理与调节代谢功能的重要性[1]。大量研究表明，从天然蛋白质中可获得的各种功能活性肽，如免疫调节肽、激素肽、酶抑制肽等，其中具有降血压活性的血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽研究最为详细。目前已从牛奶蛋白、鱼类蛋白、大豆蛋白等食物资源中分离出具有ACE抑制活性的多肽－即ACE抑制肽，目前微生物发酵或蛋白酶水解是生产ACE抑制肽的最常用方法[1~2]。来源于食物蛋白的ACE抑制肽无毒、无副作用，显示出良好的应用前景。本文综述了ACE 抑制肽的生理活性、评价方法和研究进
展。
1 ACE抑制肽的作用机制和结构特点
1.1 ACE抑制肽的作用机制
收稿日期：2006-03-01
作者简介：吴炜亮，广硕士研究生，研究方向为食品生物技术
通讯作者：吴国杰，副教授，研究方向为高分子功能材料与生物技术
ACE是一种膜结合的二肽羧基酶，是一种糖蛋白，含有维持其活性所必需的Zn2+和Cl-，广泛存在于人体组织及血浆中，在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富[1-3]。ACE是多功能酶，在体内肾素--血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System, RAS）和激肽释放酶--激肽系统（Kallikrein-Kinin System, KKS）中，对血压的调节起着重要的作用。
RAS系统KKS系统
血管紧张素原激肽原
榕榕
↓←肾素↓←激肽释放酶血管紧张素I 激肽
↓←---------ACE--------→↓
血管紧张素Ⅱ失活片断
血压升高
图1 ACE作用机制
RAS系统是调节血压的重要内分泌系统，系统中的肾素是一种蛋白分解酶，能将血管紧张素原水解释放出血管紧张素I（AngⅠ），而AngⅠ是ACE的底物，ACE水解AngⅠ羧基末端的二肽（His-Leu），生成血
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管紧张素Ⅱ（AngⅡ），其是RAS系统中的最主要生物活性成分。AngⅡ是已知最强的收缩血管物质之一，它可以使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应。
KKS系统是人体内源性降压系统，激肽释放酶作用于无活性的激肽原，生成具有血管舒张功能的激肽。
ACE在KKS系统中能使缓激肽失活，转变为没有活力的缓释肽，使KKS系统处于抑制状态，导致血管收缩占优势，血压升高。
RAS和KKS在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡对维持正常血压有重要作用，平衡失调是高血压发病的重要因素之一。由于ACE在RAS和KKS系统中对血压调节起重要作用，抑制ACE活性对降低血压有积极的影响。ACE拥有两个具有活性的作用位置，分别为N-区和C-区，它们具有几乎相同的功能。ACE抑制肽是对ACE活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，与ACE的亲和力比AngⅠ或舒缓激肽的强，而且不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE 催化水解AngⅠ成为AngⅡ，及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程，起降血压作用[2~3]。
1.2 ACE抑制肽的结构特点
ACE抑制肽指的是一类具有抑制ACE活性的相对分子量较小的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各不相同，但都具有类似的功能。不同ACE 抑制肽中结构-活性的关系表明，ACE底物的C-末端三肽序列强烈影响其同ACE的结合。ACE似乎更倾向于同C-末端3个位置上为疏水性氨基酸的底物或竞争性抑制剂结合。Cheung等研究认为，ACE抑制肽的C-端氨基酸是与ACE活性部位结合的关键。活性较强的ACE抑制肽C-端氨基酸一般为具环状结构的芳香族氨基酸或脯氨酸；在N-端最具活性的是长链或具支链的疏水氨基酸或碱性氨基酸，脯氨酸除外[1,3]。
2 ACE抑制肽的评价方法和提纯方法
2.1 ACE抑制肽的评价方法
目前ACE抑制肽活力主要采用体内和体外两种方法进行评价。
动物实验即原发性高血压鼠的活体检测方法，用切尾法测量原发性高血压鼠摄入ACE抑制肽前后动脉收缩压的变化来测定ACE抑制肽作用的强弱[3]。
体外检测常用三种方法，第一种是紫外分光光度法，Cushman提出根据ACE在体内特异性切下肽C-末端的两个氨基酸的作用原理，选择含有马尿酸（Hip）的三肽作为底物，并加入ACE和ACE抑制肽共同反应，通过228nm测定Hip的光吸收，测出的数值即为常用指标IC50（抑制ACE活性50%所需ACE抑制肽的浓度，常用µmol/L表示）；第二种是谱法，通过高压液相谱仪及谱柱检测产物中的Hip含量。此方法具有灵敏度高，准确性好的特点。徐榕榕[5]等（2005年）建立了一套利用高效液相谱测定ACE 抑制肽活性的方法，在该方法下测定ACE水解马尿酰组氨酰亮氨酸后产生的马尿酸的量得到ACE抑制肽的活性，方法简便快速，有较好的重复性，其测量结果与改良Cushman和Cheung法的结果基本一致；第三种是可见光光度法，将ACE作用的底物由含有马尿酸的三肽换为带有蓝的FAPGG，在ACE作用后光吸收减弱，通过光吸收减弱的程度来评价ACE 抑制肽的活性，此方法不用乙酸乙酯浸提，不需使用高效液相谱，方便使用。此外金等提出了用酶偶联法测定ACE抑制肽活性，此法以Hip-Gly-Gly为底物，
ACE作用后生成Hip和双甘肽，再加入GGCN和GGT，催化生成3-羧基-4-硝基苯胺，于410nm检测光吸收，此法操作简便，重复性好[3-4]。
2.2 ACE抑制肽提纯方法
目前广泛采用的ACE抑制肽的分离纯化方法可以分为三步：首先用活性炭吸附除去较高分子量、未水解的蛋白质；然后用超滤除去不溶底物，分子量较大的蛋白质和肽类以获得合理的短肽；再根据分子大小，将混合物通过凝胶过滤层析柱进行分离，因ACE 抑制肽的结构相近，分子量差别小，需和离子交换层析柱串联使用[6]。
Hee-Guk Byun等用Sephadex G-25离子交换层析和反相高效液相谱分子法从鳕鱼皮肤中分离出两种具有ACE抑制活性的三肽。张佳程[7]等采用超滤方法对瑞士乳杆菌发酵乳进行浓缩分离，工艺的最适条件为发酵乳在40℃条件下经400目滤布袋过滤获得乳清，将此乳清直接用于超滤，不需调整pH，不需预过滤，在室温，1.38×105Pa压力条件下，获得具有ACE 抑制活性的产品。
3 不同食物来源的ACE抑制肽
3.1 乳蛋白来源的ACE抑制肽
目前，从牛奶蛋白质中使用酶法水解提取ACE 抑制肽是研究最多的。1982年-1985年，Maruyama 等从
牛乳酪蛋白胰蛋白酶水解物分离纯化出具有ACE抑制活性的十二肽、七肽、六肽和五肽。其中五肽是用脯氨酸专一性内肽酶水解十二肽得到的，其抑制活性是十二肽的13倍左右。在此研究基础上，Maruyama等人通过液相合成法合成了16条肽，证实
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ACE的从C-端起第3个氨基酸残基显示了高度的立体专一性，并发现五肽的C-端三肽对于ACE抑制活性很重要。
1989年，Konmura等人以人乳α-酪蛋白的材料合成了69条C-端含脯氨酸的片段，经研究证实39-52区域为主要活性区。1990年，此研究者又以人乳κ-酪蛋白为材料合成23条肽片段，末端都含脯氨酸或疏水性氨基酸（V al, Tyr）；经体外法测定Thr-Ala-Pro片段抑制活性最强。由以上两组实验，Konmura得出结论乳蛋白肽片段中C-端含脯氨酸残基可能有潜在的ACE抑制活性。
此外，Y amamoto等对Lactobacillus Helveticus CP790蛋白酶水解αS1-酪蛋白和β-酪蛋白进行研究，发现两种酪蛋白的水解物在很大程度上具有活性。2000年Pihlanto-Leppala利用胰蛋白酶单一水解或利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合水解乳清蛋白，水解物具有较强ACE抑制活性，并通过HPLC 分离提纯出几种ACE抑制肽。2005年，李朝慧等采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽，通过体外检测法证实，碱性蛋白酶水解物的ACE抑制率最大，
并通过三因素二次通用旋转设计对碱性蛋白酶水解乳清蛋白的水解条件进行优化，建立了回归方程和确定了最优水解条件[1, 8-12]。
3.2 发酵食品来源的ACE抑制肽
发酵乳制品主要是利用乳酸菌发酵，虽然乳酸菌的蛋白质水解酶系统较弱，但其胞外蛋白酶限制性的水解乳蛋白质并释放于培养基中供细胞生长所需。在众多乳酸菌中Lactobacillus Helveticus有较强的蛋白水解活性。1995年，Nakamura以Lactobacillus Helveticus和Saccharomyces Cerovisiae菌株作为乳发酵剂制成Calpis酸乳，并且通过四步HLPC从Calpis 酸乳中纯化了VPP和IPP两种ACE抑制肽。Y amamoto 研究发酵产品中常用的16种乳酸菌制成的发酵乳的抗高血压效应，由几种L.Helveticus菌株发酵的乳在SHR鼠中表现出抗高血压效应，而其它种类的乳酸菌发酵乳则没有显著的抗高血压活性，迄今为止，只有L.Helveticus发酵的乳的抗高血压作用的报道。2005年，潘道东等通过四步反相高压液相谱从L. Helveticus和Lactobacillus casei subsp casei制作的酸乳中分离到对ACE活性具有较强抑制作用的活性肽VPP和IPP，IC50分别为8.89和5.17µmol/L，此研究者对瑞士乳杆菌JCM1004发酵乳的ACE活性抑制作用进行了研究，并总结出发酵培养20h的发酵乳含有数量最多的ACE抑制肽。
除了从发酵乳中分离纯化得到ACE抑制肽外，1994年，Saito等从清酒和酒糟中分离出9种ACE抑制肽，并证实每种肽的C-端为Try和Tyr残基。2000年，Nakamura和Saito等人从7种干酪中分离得到34条具有ACE抑制活性的肽并且对SHR鼠有降血压作用[11-14]。
3.3 鱼蛋白来源的ACE抑制肽
从鱼蛋白质中提取ACE抑制肽仅次于牛奶中提取的ACE抑制肽。1986年，Suesuna和Osajima最先报道了沙丁鱼和带鱼的水解物中含有ACE抑制肽，分子量为1000-2000。1994年，Matsufuji利用碱性蛋白酶水解沙丁鱼获得11种ACE抑制肽，其中抑制活性最强的肽为Lys-Tyr（LT）。Ukeda研究发现胃蛋白酶水解沙丁鱼可产生最强的ACE抑制成分，在酶解之前对沙丁鱼进行热处理，其水解物可获得更强的抑制活性。1999年，Hiroyuki从鲣鱼中分离出一种5肽Leu-Lys-Pro-Asn-Met，与ACE作用生成三肽LKP，对ACE的抑制作用提高8倍[8, 11]。
3.4 植物来源的ACE抑制肽
除了从动物蛋白质中提取ACE抑制肽外，还可以从植物蛋白质中水解分离出具有ACE抑制活性的短肽。Miyoshi等从天然α-玉米蛋白嗜热菌蛋白酶水解物中分离出多种ACE抑制肽，N-末端为Leu残基的三肽具有较强抑制活性。2000年，Matsui研究了麦芽水解物的ACE抑制活性，并从中分离出具有ACE 抑制活性的三肽IVT，同时Matsui发现IVT在血浆中可被氨基肽酶降解为另一个具有ACE抑制活性的二肽VT。1998年，吴建平从大豆水解物中分离出Asp-Leu-Pro（ALP）和Asp-Gly（AG）两种ACE抑制肽，并证实此二种肽对SHR鼠有显著降压效果，但对正常鼠无显著影响。2004年，张国胜等人以大豆分离蛋白为原料，选用4种商业蛋白酶水解获得大豆蛋白ACE抑制肽，并以水解度为指标设计正交实验得出，在pH
值为8.0，温度为45℃，酶与底物浓度比6%时，水解480min得到的ACE抑制肽活性最强。2003年，辛志宏等人用8种蛋白酶分别对小麦麦胚蛋白进行单一酶和复合酶水解制备ACE活性肽，通过HPLC 的活性测定发现，碱性蛋白酶生产水解物的活性最大，在最适pH为9，温度为50-55℃，加酶量为24Au/Kg，水解度为16.5%时得到活性最高的ACE抑制肽。1998年，Kunio从大蒜中分离出7种具有ACE抑制活性的二肽，并发现其活性按肽N-端氨基酸Phe、Asn、Ser、Gly依次降低[8, 10-11, 15-17]。
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3.5 其他食品来源的ACE抑制肽
1979年，Oshima等首次报道了利用细菌胶原酶水解凝胶并从其水解物中分离出6条抑制肽，肽中的N-端有Gly-Pro序列，C-端有Ala-Hyp序列[8]。
1995年，Hiroyuki从卵清蛋白中分离出一种八肽，将八肽同30%蛋黄液乳化和未经乳化的ACE抑制肽液等量分别喂养SHR鼠，证明乳化后的ACE抑制肽液具有较高的降压活性，这可能因为乳化后的降压肽易于吸收和难被消化酶降解。2001年，Hiroshi将鸡蛋蛋黄水解物经超滤后，分子量控制在1Kda以下，发现水解物在体外具有ACE抑制活性，但水解物的结构尚未阐明[8,10]。
1996年，任维栋等人将猪骨胶原蛋白粗提物用胰蛋白酶水解，经过阳离子交换树脂层析，Sephadex G-
25柱凝胶过滤，以及反复数次反相高效液相层析，获得一具有ACE抑制活性的多肽，其氨基酸组成为Ile、His、Ser、Gly、Ala、Pro、Tyr、Leu、Asp[18]。
2005年，徐鑫等人采用酪朊酸钠制备ACE抑制肽获得成功，实验采用商业化的胰蛋白酶对底物浓度为10%酪朊酸钠进行可控酶解，将酶解液的上清液进行超滤膜分离后，利用紫外分光光度法测定ACE体外抑制活性，表面酪朊酸钠的胰蛋白酶酶解液具有较强的ACE抑制活性[19]。
4 发展前景
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病。全世界每年因高血压而死亡1200万人。在我国，高血压的发病率随着经济的增长也逐年增高。目前，全国高血压患者近1亿人，每年死于心血管病的人数达200万，已高居死亡原因的首位，高血压为其主要的危险因素。调查显示，高血压患者中，大多数使用合成ACE抑制剂控制血压的升高，合成ACE抑制剂具有药效快而强的特点，但对肾功能有一定的副作用。从天然食物中分离的ACE抑制肽，虽然降压效果没有合成药物明显，但其对正常血压无影响、没有毒副作用等特点吸引了众多的研究者。
天然的ACE抑制肽最早是Ferriera在1965年从美洲茅头蝮蛇毒中发现的。随后众多关于ACE抑制肽的研究迅速的开展起来，并从多种不同的天然食物蛋白中发现了短链的ACE抑制肽。日本是研究ACE 抑制肽最多的国家，主要从乳源蛋白质中提取，其次是鱼蛋白，其中已有一部分实现工业化生产。我国在这方
面的研究尚属起步阶段，目前仅有少量报道。我国具有丰富廉价的动植物蛋白资源，如何合理利用好现有的资源加工制备高活性ACE抑制肽是今后研究方向之一。在制备技术，生产成本和生理效果等方面也应做出更大的突破，这些研究的进展将促进具有良好的市场前景和社会效益的ACE抑制肽的开发应用。
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