52020396
2021401遗传性长QT 综合征（hereditary long QT syn-drome ，hLQTs ）是因编码心肌离子通道蛋白基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能障碍的一组临床综合征，常于青少年发病，是青少年猝死的主要原因。
其中Ⅱ型长QT 综合征（long QT syndrome 2，LQT2）的发生与快激活延迟整流钾电流（rapidly activating component of delayed rectifier potassium current ，I Kr ）的减少有关，这是由于编码I Kr 通道α亚单位的人类ether-a-go-go 相关基因（human ether-a-go-go-related gene ，hERG ）的突变引起[1]。迄今为止，已发现了500多个hERG 基因突变位点，其中大多为错义
突变[2-3]，G572R 突变是其中之一。已知G572R 突变导致其编码的蛋白质合成和转运障碍，突变蛋白滞留于内质网，无法转运至细胞膜上形成有功能的离子通道，导致编码的I Kr 电流减少和心室复极延迟。目前对LQT2患者缺乏特异性诊断及有效方
[摘要]目的
探讨E-4031对遗传性长QT 综合征人类ether-a-go-go 相关基因（hERG ）通道功能的影响。
方法
构建杂合型WT/G572R-hERG 细胞株，根据E-4031是否干预分为观察组和对照组。Western blot 检测两组hERG 通道蛋白表达，全细胞膜片钳技术检测两组hERG 通道激活电流、尾电流、稳态失活电流和失活恢复电流的变化。
结果
观察组
155-kDa 蛋白质条带明显高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。观察组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度[（416.32±90.37）、（897.25±92.05）pA]均高于对照组[（219.34±28.98）、（566.61±121.60）pA]，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；观察组和对照组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电压[（-83.39±1.45）mV 比（-69.05±2.58）mV]差异有统计学意义（P ＜0.05）。
结论
E-4031能改善WT/G572R-hERG 通道功能。
[关键词]遗传性长QT 综合征
人类ether-a-go-go 相关基因
快激活延迟整流性钾电流
E-4031
The effect of E-4031on hERG channel function in hereditary long QT syndrome HUANG Xiaoyan,WANG Ying,LIAN
Jiangfang.Central Laboratory,Ningbo Medical Center LiHuiLi Hospital,Ningbo 315040,China Corresponding author:LIAN Jiangfang,[Abstract]
Objective
To investigate the effect of E-4031on human ether-a-go-go-related gene （hERG ）channel
function in hereditary long QT syndrome.
Methods
Heterozygous WT/G572R-hERG cell lines were constructed and
divided into observation group and control group according to whether incubated with E-4031.Western
Blot was performed to detect the expression of hERG channel.The whole-cell patch-clamp technique was used to assess active current of hERG,tail current,steady-state inactivation current and recovery current.Results
The 155-kDa protein band
was significantly higher in observation group than in control group (P ＜0.05).The activation current of the hERG channel and the maximum tail current were significantly higher in observation group [(416.32±90.37),(897.25±92.05)pA]than in control group[(219.34±28.98),(566.61±121.60)pA](all P ＜0.05).The maximum half-inactivation potential of steady-state inactivation of hERG current was significantly different between the two groups[(-83.39±1.45)mV vs (-69.05±2.58)mV]（P ＜0.05）.Conclusion E-4031may improve WT/G572R-hERG channel function.
[Key words]
Hereditary long QT syndrome hERG
Rapidly activating delayed rectifier K +current E-4031
E-4031对遗传性长QT 综合征hERG 通道功能影响的研究
黄晓燕王英廉姜芳
DOI ：10.12124/j.issn.2095-3933.2021.1.2019-3891
基金项目：宁波市自然科学基金资助项目（2019A610340、2019A610343）
作者单位：315040
宁波市医疗中心李惠利医院中心实验室
（黄晓燕），心内科（王英、廉姜芳）
通信作者：廉姜芳，E-mail ：35··
5 202039
6 2021401
法。本研究探讨药物E-4031对WT/G572R-hERG 杂合型通道功能的影响，现将结果报道如下。
1材料和方法
1.1主要试剂DMEM培养基购自美国Thermo scientific公司；转染试剂（Lipofectamin TM2000）购自美国Invitrogen公司；兔抗hERG多克隆抗体购自以列Alomone公司；E-4031购自德国Calbiochem公司；膜片钳系统及分析软件为美国Axon公司产品。
1.2方法
1.2.1细胞培养、转染HEK293T细胞常规用含10%胎牛血清DMEM培养基培养，根据转染试剂提供的实验步骤，将2.5μg pcDNA3-WT-hERG质粒和2.5μg pcDNA3-G572R-hERG质粒，瞬时转染HEK293T细胞，构建WT/G572R-hERG细胞株。同时共转染0.8μg绿荧光蛋白以监测转染效率。1.2.2药物干预构建WT/G572R-hERG细胞株后，将其分为两组，观察组加入E-4031孵育24h，作用浓度为5μmol/L。对照组用含10%胎牛血清DMEM培养基常规培养24h。
1.2.3hERG通道蛋白表达的检测采用Western blot法检测两组hERG通道蛋白的表达。收集两组细胞，加入预冷蛋白裂解液。取裂解上清液加样，经7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至聚偏二氟乙烯膜。一抗兔抗hERG多克隆抗体1∶400稀释，4℃孵育过夜。二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体1∶1000稀释，室温孵育2h，最后在化学发光成像仪中观察拍照。
1.2.4hERG通道激活电流和尾电流的检测采用全细胞膜片钳技术观察两组hERG通道激活电流和尾电流的电流幅度、半激活最大电压和斜率因子。电极外液配方：NaCl137mmol/L，KCl4mmol/L，CaCl2 1.8
mmol/L，MgCl2·6H2O1mmol/L，葡萄糖10mmol/L，HEPES10mmol/L（最后加入NaOH将pH调至7.4）。电极内液配方：KCl130mmol/L，MgCl21mmol/L，EGTA5mmol/L，Mg-ATP6mmol/L，HEPES10mmol/L （最后加入KOH将pH调至7.2）[4-5]。灌注电极内液后电极入水电阻为3～7mΩ；刺激程序由Clampex 9.2软件和Axon700B放大器共同完成，信号经过Axon700B放大器和A/D转换后储存于计算机中。将细胞钳制在-80mV，测试电压以10mV阶跃从-60mV刺激到+60mV，持续时间2s；然后去极化到-40mV，持续4s；最后回到-80mV[4-5]，记录hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅度。对在-40mV 记录到的尾电流经最大电流标准化，用Boltzmann 方程拟合，得出两组半激活最大电压和斜率因子并进行比较。
1.2.5hERG通道稳态失活电流的检测方法同hERG通道激活电流和尾电流。测试电压以10mV 阶跃从-130mV刺激到20mV，持续时间20ms；然后测试电压钳制在20mV时记录hERG通道稳态失活电流，经最大电流标准化，用Boltzmann方程拟合，得出两组半失活最大电压和斜率因子并进行比较。
1.2.6hERG通道失活恢复电流的检测方法同hERG通道激活电流和尾电流。电压钳制在-80mV，复极至50mV使通道失活，接着以10mV的阶跃从-30mV刺激到-120mV，持续时间3s，记录两组hERG通道失活恢复电流，用单指数方程进行拟合得到失活恢复时间常数并进行比较。
1.3统计学处理采用Excel和Origin7.5软件对原始数据进
行统计、拟合和作图。计量资料
示，两样本比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组hERG通道蛋白表达的比较见图1。
由图1可见，对照组在135kDa和155kDa出现两条蛋白质条带，而观察组155kDa的蛋白质条带明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。
图1两组hERG通道蛋白表达的比较（A：两组hERG蛋白条带的变化，B：两组hERG蛋白的灰度值比较；与对照组比较，*P＜0.05）A对照组观察组
155kDa--
135kDa--
55kDa--
IB：hERG（WT/G572R）
IB：内参
B 2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
对照组观察组
*
36··
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20214012.2两组hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅
度、半激活最大电压和斜率因子的比较
见图2。
由图2可见，对照组hERG 通道激活电流和尾
电流的最大电流幅度分别是（219.34±28.98）pA 和（566.61±121.60）pA ，而观察组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度分别是（416.32±90.37）pA 和（897.25±92.05）pA 。与对照组比较，观察组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度分别增加了89.81%和58.35%，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。此外对照组尾电流拟合后半激活最大电压和斜率因子分别是（4.51±0.41）mV 和（8.99±0.37），观察组分别是（6.37±1.09）mV 和（10.40±0.99），两组尾电流拟合后半激活最大电压和斜率因子比较，差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。2.3
两组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电
压和斜率因子的比较
见图3。
由图3可见，观察组和对照组hERG 通道稳态
失活电流半失活最大电压分别为（-83.39±1.45）mV 和（-69.05±2.58）mV ，差异有统计学意义（P ＜0.05）；斜率因子分别为（24.99±1.18）和（28.94±2.90），差异无统计学意义（P ＞0.05）。2.4
两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较见图4。
由图4可见，两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。3
讨论
LQT2是由于hERG 基因突变引起的一组心脏离子通道病。hERG 基因编码的蛋白是由4个亚基组成的四聚体，每个亚基有6个跨膜片段（S1-S6），其中S5-S6之间的疏水性环为最保守的区域，向膜内折叠形成离子孔道的孔区。正常的hERG 通道蛋白有两种形式：一种是存在于内质网未完全糖基化的135kDa 大小前体；另一种是经高尔基体复杂糖
图2两组hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅度、半激活最大电压和斜率因子的比较（A ：两组hERG 通道激活电流和尾电流图；B ：两组激
活电流的电流幅度；C ：两组尾电流的电流幅度；D ：两组尾电流经拟合得出半激活最大电压和斜率因子）
A
300pA
1s
60mV
-60mV -40mV
对照组
观察组
B
500400
3002001000
对照组
观察组
-40
-200204060
测试电压（mV ）
C 10009008007006005004003002001000-100
-60-40
-2002040
60
测试电压（mV ）
-60
对照组观察组
对照组
观察组
1.00.80.60.40.20.0
-40
-20020
40
60
-60
测试电压（mV ）
D李惠利
37··
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2021401基化修饰后，插入细胞膜上的成熟的155kDa 大小通道蛋白。G572R 错义突变位于hERG 通道的S5跨膜片段末端，572位的甘氨酸被精氨酸所取代。G572R 突变发生时，突变的通道蛋白会与野生型蛋白结合形成杂合型通道（Western blot 表现为155kDa 和135kDa 两个蛋白条带，但155kDa 的蛋白质条带明显弱于野生型细胞），滞留于内质网中，从而减少野生型蛋白在细胞膜上的表达，使细胞膜上有功能的离子通道减少[6]。这些突变蛋白尤其是杂合型通道，并非功能完全丧失，若对其调控后能部分纠正或者恢复正常转运，仍能发挥一定的代偿功能[7-9]。
药物分子对突变蛋白的改善和纠正作用一直以来都是研究的热点[10]。E-4031属于Ⅲ类抗心律失常药。有研究报道发现，G601S 、R534C 、A422T 、V630L 和N407D 突变，其编码的HERG 钾通道存在蛋白转运障碍，可以被E-4031所部分纠正或恢复，但A561V 、H562P 、R752W 、F805C 和R823W 突变体则不能被E-4031所纠正[11-13]。本研究发现，与对照组比较，观察组hERG 通道蛋白质条带明显增强；全细胞膜片钳检测发现，hERG 通道激活电流幅度和尾电流幅度较干预前分别增加了89.81%和58.35%。可见E-4031对G572R 突变导致的蛋白转运障碍起到了部分改善和纠正作用。此外，E-4031干预使得hERG 通道稳态失活电流的电向明显负向移动14.34mV ，可见E-4031干预还加速了通道电流的稳态失活速度。
对于不同的hERG 基因突变位点，E-4031处理有着不同的反应，这提示不同突变位点的蛋白构象及功能缺失的机制存在不同。本研究发现E-4031能改善WT/G572R-hERG 通道功能。因此，通过药物分子对HERG 通道功能的调节作用，以期从调控蛋白质转运角度，为改善HERG 通道功能提供有效方法。
参
考文献
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图4
两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较（A ：两组hERG 通道失活恢复电流图；B ：通道电流失活恢复时间常数图）
A
B 对照组观察组
50mV
-120mV
300pA -30mV
对照组观察组
121086420
-120-100
-80-60
-40-20
测试电压（mV ）
图3
两组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电压和斜率因子的比较（A ：两组hERG 通道稳态失活电流图；B ：稳态失活电流经拟合得出半失活最大电压和斜率因子）
A
500pA
50ms
20mV
-80mV
-130mV
对照组
观察组
B
对照组观察组
1.00.80.60.40.2
-80-40-20
02040
测试电压（mV ）
-60-100-120-14038··
5 202039
6 2021401
（上接第34页）
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（收稿日期：2020-06-10）
（本文编辑：杨丽）
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（收稿日期：2019-11-26）
（本文编辑：杨丽）
39··
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