(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810693753.3
(22)申请日 2018.06.29
(83)生物保藏信息
CCTCC No：C201827 2017.12.28
(71)申请人 上海市皮肤病医院
地址 200443 上海市静安区保德路1278号
(72)发明人 王秀丽　王宏伟　吉杰　
(74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限
公司 31225
代理人 褚明伟
(51)Int.Cl.
C12N  5/09(2010.01)
A01K  67/027(2006.01)
C12R  1/91(2006.01)
(54)发明名称
SKH -1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤
模型制备中应用
(57)摘要
本发明公开了SKH -1小鼠皮肤鳞癌细胞系及
其在移植性瘤模型制备中应用，命名为XL50，保
吉杰藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是
CCTCC  No：C201827。本发明内容包括UV诱导小鼠
构建SCC模型；原代培养小鼠皮肤鳞癌细胞XL50；
小鼠皮肤鳞癌细胞XL50成瘤性试验；构建SKH -1
小鼠移植性皮肤鳞癌模型。本发明的细胞生长良
好并能连续传代，稳定增殖，其培养条件、传代及
冻存方法均为常规细胞培养技术，便于操作。细
胞的细胞增殖较快，细胞恶性度较高。制备出的
细胞株能很好的应用于构建具有免疫原性的移
植性瘤模型，既弥补了原有的小鼠SCC模型建模
周期过长和肿瘤的大小的局限性，又弥补了裸鼠
移植性肿瘤免疫功能缺乏的不足，为今后SCC相
关免疫机制的研究提供了一个很好的模型。权利要求书2页  说明书10页  附图4页CN 110656085 A 2020.01.07
C N  110656085
A
1.一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，其特征在于，命名为XL50，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC No：C201827，保藏日期为2017年12月28日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。
2.根据权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，其特征在于，所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系为上皮组织来源。
3.权利要求1所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型；
(2)小鼠SCC细胞株的原代培养：取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块进行原代培养；
(3)原代培养细胞的纯化：采用酶消化法联合差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化SCC细胞，即得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系。
4.根据权利要求3所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，其特征在于，步骤(1)所述UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型的方法为：
采用日光紫外线模拟器对小鼠背部皮肤进行照射，照射剂量为最小红斑量MED，照射至小鼠出现米粒大小丘疹，即停止照射，得到小鼠SCC模型。
5.根据权利要求3所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，其特征在于，步骤(2)所述小鼠SCC细胞株的原代培养的方法为：
剪取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块，剔除肿瘤表明痂皮和坏死组织，用含有2％双抗的PBS冲洗，洗去血渍；将清洗干净的瘤块，置于盛有高糖DMEM培养基中，剪除结缔组织和黏膜下血管后将瘤体剪碎，收集至含有1％双抗的PBS中，离心清洗，直至液体澄清；弃上清，加入与肿瘤组织块体积相等的0.25％胰蛋白酶-EDTA分次消化，用10％FBS DMEM培养液等体积中和终止消化，离心，弃上清，再次消化，直至组织溶解为黏稠状；加入0.2％Ⅰ型胶原酶振荡消化，至组织完全溶解，离心，收集细胞；无血清高糖DMEM清洗，加入含20％FBS、2％双抗和10ug/ml双性霉素B的高糖DMEM培养液，充分吹打后制成单细胞悬液，接种培养。
6.根据权利要求3所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，其特征在于，步骤(3)所述原代培养细胞的纯化的方法为：
当细胞达到80％～90％汇合时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA胰酶消化细胞，SCC细胞5代之内培养液为含20％FBS、2％双抗和10ug/ml双性霉素B的DMEM培养液，1：2传代，SCC细胞10代后培养液更改为10％FBS、1％双抗，按1:3传代，得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系。
7.权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用。
8.根据权利要求7所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用，其特征在于，BALB/c裸鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。
9.根据权利要求7所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用，其特征在于，SKH-1小鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。
10.一种SKH-1小鼠移植性皮肤鳞癌模型的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液注射SKH-1小鼠皮下，得到SKH-1小鼠移植性皮肤鳞
癌模型。
SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型制备中应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型中应用。
背景技术
[0002]皮肤鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma，SCC)作为人类常见的皮肤恶性肿瘤之一，约占非黑素性皮肤肿瘤的20％。SCC的发生与紫外线(Ultraviolet，UV)密切相关，并且近年来随着全球环境破坏导致臭氧层受损加重，SCC的发病率也逐年上升。由于SCC发展较快并可发生转移，预后较差，已成为威胁人类健康的主要皮肤肿瘤，越来越受到人们的重视。SCC主要与过度UV暴露导致的DNA损伤相关，但其具体发生、发展机制尚未完全阐明。传统的方法，包括手术、激光、冷冻和放疗等，虽然可以直接去除或破坏肿瘤组织，但仍存在较高复发率，如何有效防治SCC并降低其复发率是当前亟需解决的临床难题。
[0003]人类肿瘤的发生、发展机制和防治等相关的基础研究，均需要与人肿瘤发生相似的动物模型和细胞系。体外分离和培养肿瘤细胞并建立相关肿瘤细胞系，是研究肿瘤的重要资源和手段，有利于促进肿瘤相关的分子细胞学机制和药物疗效的研究。体外培养肿瘤细胞应用研究具有许多优点：1)可免受机体内环境影响避免个体差异对实验结果造成的影响，有利于分析各种外界因素对肿瘤细胞的作用；2)一方面可从细胞水平观察、研究肿瘤细胞的结构及功能，另一方面也能在基因及分子水平分析癌变机理；
3)有利于快速耐药机理的研究，便于筛选抗癌药物；4)可缩短研究周期，更加经济。因此，建立与人SCC发生相似的肿瘤细胞系和构建合适的动物模型是研究SCC癌变机理和防治的重要方法。[0004]目前，UV诱导和二甲基苯蒽(7,2-dimethyl-1,2-benz[a]anthracene,DMBA)化学诱导的小鼠SCC模型是国际上公认的经典小鼠SCC动物模型，已广泛用于SCC发生、发展机制的相关研究。
[0005]现有技术有采用SKH-1无毛小鼠，通过日光紫外线模拟器照射成功构建了UV诱发的小鼠SCC模型。但该造模方法存在建模时间长，UV所致肿瘤大小不一，肿瘤数量无法控制等问题，因此构建一个成瘤周期短，可有效控制瘤体体积和数量的的移植性SCC模型非常必要。
[0006]有关皮肤SCC细胞系建立的研究可追溯到1975年。1975年Moore成功分离并建立了人SCC细胞株COLO16，随后逐渐建立了HSC-I和HSC-Ib，HSC-5，SCL-1，SCC-1CB等人SCC细胞系，这些细胞系的建立大大促进了SCC相关分子机制研究领域的发展。目前运用最多的鳞癌细胞系为SCL-1细胞。与口腔、食道、膀胱和肺鳞状细胞癌细胞系的建立相比，有关人皮肤鳞状细胞癌细胞系建立的报道较少，而且很少有与人皮肤鳞状细胞系相匹配的直接从小鼠SCC动物模型的SCC组织中分离而建立的细胞系。2010年Hsieh等报道了从DMBA/TPA二阶段法诱导的骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)缺乏小鼠SCC组织中成功分离OPN缺陷小鼠皮肤鳞细胞系，并通过皮下接种成功构建了具有健全免疫力的小鼠SCC种植瘤模型。
[0007]OPN是一种磷酸化糖蛋白，最早因其从骨基质中分离而得名。OPN与恶性肿瘤细胞的增殖，侵袭及转移等多种病理过程相关。来源于OPN缺陷的SCC组织的细胞系和移植性模
型，具有一定的局限性，限制了其在SCC生物学特性和癌变机理的研究中的应用。因此，建立与人SCC发生相似的小鼠SCC细胞系和构建具有健全免疫力的小鼠SCC移植性模型是非常必要的。
发明内容
[0008]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型中应用。
[0009]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0010]一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，命名为XL50，属于小鼠皮肤鳞癌细胞，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC No：C201827，保藏日期为2017年12月28日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。
[0011]本发明在已建立的UV诱导SKH-1无毛小鼠SCC模型基础上，通过分离和体外培养，得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，并对其生物学特性进行了鉴定。
[0012]所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，包括以下步骤：
[0013](1)UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型；
[0014](2)小鼠SCC细胞株的原代培养：取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块进行原代培养；[0015](3)原代培养细胞的纯化：采用酶消化法联合差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化SCC细胞，即得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系。
[0016]在本发明一个实施方式中，步骤(1)所述UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型的方法为：[0017]从美国JAKSON实验室引进的免疫功能正常的SKH-1无毛小鼠，在上海市公共卫生中心繁殖，选取6-8周龄、雌性SKH-1无毛小鼠，采用接近太阳光谱的日光紫外线模拟器对小鼠背部皮肤进行照射，日光紫外线模拟器照射距离为30cm，照射至小鼠皮肤的实际输出功率为UVB 3.0mW/cm2，UVA 27mW/cm2，照射剂量为最小红斑量MED，每周连续照射5天，照射24周，至小鼠出现米粒大小丘疹，即可停止照射，得到小鼠SCC模型，荷瘤小鼠的瘤体体积逐渐增大，数目也逐渐增多。组织学符合鳞状细胞癌病理诊断。免疫组化CK蛋白及Vim蛋白染阳性。
[0018]在本发明一个实施方式中，步骤(2)所述小鼠SCC细胞株的原代培养的方法为：[0019]劲椎脱臼法处死UV诱导28周后的SCC荷瘤小鼠。将小鼠放入盛有75％酒精的换药碗中浸泡消毒10分钟，剪取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块，剔除肿瘤表明痂皮和坏死组织，用含有2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)的PBS冲洗3次，洗去血渍；将清洗干净的瘤块，置于盛有高糖DMEM培养基的换药碗中，用眼
科剪剪除结缔组织和黏膜下血管后将瘤体剪碎至肉末状，约1～2mm3大小，收集至含有1％双抗的PBS 15ml离心管中，1000rpm/ min，5min，离心清洗3次，直至液体澄清；弃上清，根据肿瘤大小加入与肿瘤组织块体积相等的0.25％胰蛋白酶-EDTA分次消化，用10％FBS DMEM培养液等体积中和终止消化，每次消化8～10min，1000rpm，5min离心，弃上清，再次消化，直至组织溶解为黏稠状；加入0.2％Ⅰ型胶原酶振荡消化30min左右，至组织完全溶解，1000rpm/min，离心5min，收集细胞；无血清高糖DMEM清洗3遍，加入含20％FBS、2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的高糖DMEM培养液，充分吹打后制成单细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中培养，接种细