（2005.12）
姓名 学号 得分
一 名词解释（4分/题，共20分）
1． 重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因
2．.锌指结构
由两个半胱氨酸（Cys）残基和两个组氨酸（His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构, 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位, 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关
3．.ScFv
它是由抗体重，轻链的可变区基因(VH、VL)之间通过一段编码连接肽基因，拼接后表达形成的重组蛋白。是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段，可在一些不需Fc段效应功能的实际应用中开展研究和应用。其优点是分子量小，易于穿透组织到达靶器官发挥功效，易于构建和生产，但易于被清除。
4．.基因置换
是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。
5．基因敲除
基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术。
二 填空题 （3分/题，共15分）
1. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 插入序列 、 转位子 、噬菌体Mu和D108 。
2. Klenow酶在 有 dNTP 情况下，呈现DNA聚合酶活性，在 没有dNTP 情况下呈现外切酶活性。
3. 外源基因在原核细胞中表达，常用的启动子有 乳糖启动子 、Trp启动子 、 Tac启动子 、噬菌体的PL和PR启动子 、 脂蛋白启动子 。
4. 在LacI标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显 白 ，为 阳性 克隆，未插入基因的克隆显 蓝 ，为 阴 性克隆。
5. 基因序列经碱基替代，缺失或插入后，可使遗传信息产生三种不同的后果，分别为 同义突变 、 错义突变 、无义突变 。
三 是非判断题 （2分/题，共10分）
1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。 （ × ）
2.质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。（ × ）
3．COS位点，COS质粒，COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端。（× ）
四．不定项选择题（3分/题，共15分）
1. 下列生物体的细胞基因组哪些会有断裂基因 （ AB ）
A.动物 B.人 C.细菌 D.噬菌体
2. 真核细胞基因表达的特点为 （ AD ）
A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译分开分步进行
3. 识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为 （ B ）
A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶
4. pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件 （ ABD ）
A.AmPr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点
5. λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为 （ D ）
A.小于λ噬菌体DNA的50% B. 小于噬菌体DNA的75%
C.大于λ噬菌体DNA的105% D.为λ噬菌体DNA的75%～105%
五 问答题 （8分/题，共40分）
1 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？
不能，因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统。原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子, 以催化RNA的合成。
基因表达是以操纵子为单位，操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的。因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列。
2 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？
目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端
⑴ 高背景
载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5’-P，的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。如第二章图2-6
⑵ 双向插入
经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。
3 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？
顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列的DNA片段, 决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应,按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子和终止子等DNA序列片段。
⑴ 启动子
真核基因启动子是基因表达时与基因转录起始有关的5'端DNA序列,包括在-30bp区富含有AT的典型TATA盒（框）（TATA box）和在-70～-80bp区域（在TATA box上游）启动元件。前
者是引导RNA聚合酶Ⅱ在正确起始位点转录mRNA所必需的DNA序列, 即保证转录的精确起始。后者UPE是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列，后者的序列常为GGTCAAT和GGGCCC序列, 称为GC box, 它们经协同作用,以调控基因的转录效率。
启动子的转录效率因细胞而异，因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子，以便真核基因的高效表达。常用的启动子有Rous肉瘤病毒启动子RSV和巨细胞病毒的启动子CMV。还有SV40早期启动子, 腺病毒的晚期启动子。
⑵ 增强子
增强子是使启动子的基因转录效率显著提高（增强转录活性）的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。其基本的核心组件常由812bp组成, 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在。增强子一般有以下特性：⑴增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率;⑵增强子对同源或异源基因都有效; ⑶增强子的位置可在基因5'上游、3'下游或内部; ⑷无方向性,增强子从5'→3'或是从3'→5'均可对启动子发挥作用; ⑸增强子可远离转录起始点; ⑹增强子一般无基因特异性, 对各种基因启动子均有作用, 但具有组织或细胞特异性。
典型的增强子首先发现于SV40的病毒中, 为SV40的早期基因增强子, 约200bp, 含2个72bp的重复序列, 位于早期启动子上游, 增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍，因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用。近些年来，来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒（CMV）增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达。
增强子能增强启动子的转录能力，有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上, 在某些情况下, 表达产物可能具有细胞毒效应。因此，最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子, 诱导型启动子有热休克启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子，热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高，重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性。
⑶ RNA剪接信号
多数高等的真核基因都含有内含子序列, 在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子。虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后, 其表达不受有或无内含子的影响, 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号， 以提供外源基因c
DNA表达的需要。常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等。
⑷ 苏州大学优势专业负调控元件
沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列, 称为负调控元件, 它们与反式作用因子相互结合而起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因表达起作用。
⑸ 终止子和polyA信号
真核基因转录的确切终止信号和终止机制, 目前尚不清楚, 终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的, 在不明机制下发生转录终止。现在已发现模板DNA分子的3'端有转录终止信号序列, 称终止子。通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件。一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列。现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3'端的一段序列, 其中也包括3'端不翻译区。如SV40小t抗原和β-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体。
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