表面技术
第52卷 第5期
收稿日期：2022–05–24；修订日期：2022–08–01 Received ：2022-05-24；Revised ：2022-08-01
基金项目：国家自然科学基金联合基金（U2106226）；国家自然科学基金面上基金（51972290）
Fund ：National Natural Science Foundation of China Joint Fund (U2106226); National Natural Science Foundation of China General Fund (51972290)
作者简介：李世明（1997—），男，硕士生，主要研究方向为功能水凝胶材料。
Biography ：LI Shi-ming (1997-), Male, Postgraduate, Research focus: functional hydrogel material. 通讯作者：陈守刚（1974—），男，博士，教授，主要研究方向为海洋新材料及其防护应用。
Corresponding author ：CHEN Shou-gang (1974-), Male, Doctor, Professor, Research focus: advanced marine materials and their protection. 引文格式：李世明, 李兴霖冒, 陈守刚, 等. 兼具抗疲劳和抗菌功能的双网络水凝胶的构筑及性能[J]. 表面技术, 2023, 52(5): 268-277.
LI Shi-ming, LI Xing-lin-mao, CHEN Shou-gang, et al. Preparation and Properties of Anti-fatigue and Antibacterial Double-network Hydrogel[J]. 兼具抗疲劳和抗菌功能的双网络
水凝胶的构筑及性能
李世明，李兴霖冒，陈守刚，苟江琳，李文
（中国海洋大学，山东 青岛 266100）
摘要：目的 解决水凝胶力学强度过低问题，同时赋予水凝胶抑菌功能，满足应用需求。方法 以离子交联的海藻酸盐为第1层网络，以化学交联的聚丙烯酰胺（PAAm ）为第2层网络，借助pH 缓释调节剂D–(+)–葡萄糖酸δ
–内酯（GDL ）制备Cu 2+交联的海藻酸盐–聚丙烯酰胺（TG–Cu ）抑菌水凝胶。利用傅里叶红外光谱（FITR ）、扫描电子显微镜（SEM ）、X 射线光电子能谱（XPS ）等手段表征双网络水凝胶的物理和化学结构。通过拉伸、压缩、Mullins 测试和循环拉伸试验，研究TG–Cu 水凝胶材料的力学强度和抗疲劳性能，通过细菌培养、稀释涂布平板法和活死菌荧光染手段评价水凝胶的抑菌性能，通过ICP 探究Cu 2+的释放。结果 Cu 2+交联的TG–Cu 水凝胶由离子交联和化学交联的两层网络构成，具有三维网络结构。当Cu 盐的添加量为每组分0.187 5 mol 时，其力学性能较好，弹性模量达到22.4 kPa ，断裂韧性为659.5 kJ/m 3，且具有预制缺口的凝胶样品在10 000次30%应变循环加载–卸载实验后，未观察到明显的裂纹扩展。抑菌试验结果证实，TG–Cu 水凝胶对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率最高可达99%。结论 Cu 交联TG–Cu 水凝胶材料在保证材料基体具有优异力学性能的同时又赋予其可观的功能性，实现了水凝胶结构设计与功能性的有机统一。
关键词：海藻酸盐；聚丙烯酰胺；水凝胶；力学性能；抑菌
中图分类号：TQ317 文献标识码：A 文章编号：1001-3660(2023)05-0268-10 DOI ：10.16490/jki.issn.1001-3660.2023.05.026
Preparation and Properties of Anti-fatigue and Antibacterial
Double-network Hydrogel
LI Shi-ming , LI Xing-lin-mao , CHEN Shou-gang , GOU Jiang-lin , LI Wen
(Ocean University of China, Shandong Qingdao 266100, China)
ABSTRACT: In recent years, hydrogel materials have drawn a lot of researchers' attention for its good compatibility and adaptability with various research fields. However, because of its high water-content and unique chemical structure,
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第52卷第5期李世明，等：兼具抗疲劳和抗菌功能的双网络水凝胶的构筑及性能·269·
hydrogel is usually considered with unsatisfactory mechanical properties. Double network hydrogel sta
nds out for its excellent mechanical strength and high designability. Tough hydrogel (TG) composed of alginate and polyacrylamide (PAAm) is one of the representatives. Copper ion is a widely used bacterial agent, can also be used as a physical crosslinker for alginate. In this research, a kind of alginate-polyacrylamide/Cu2+ double network hydrogels (TG-Cu) with antibacterial property was prepared. This hydrogel can be used to form antibacterial surface.
Trough water solution polymerization, TG-Cu double network hydrogel samples were prepared with sodium alginate (SA), acrylamide, basic copper sulfate, N, N'-dimethylacrylamide (MBAA) and ammonium persulfate (APS). To facilitate the crosslinking of Cu2+ and SA, D-(+)-glucono δ-lactone (GDL) was used as sustaining pH regulator. The polymerization procedure was finished in a glass mold of 8 cm×8 cm×0.5 cm. Before the chemical structure and morphology observation, the freeze-dried hydrogel sample was ground into powder with a planetary ball mill. To determine the chemical structures in the hydrogel, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) measurement was performed on K-Alpha (Thermo-Fisher, US).
Fourier transform infrared (FT-IR) spectrum of the samples were obtained with an IS-50 spectrometer (Nicolet, US) to identify the functional groups in the hydrogel. The morphology of TG-Cu hydrogel was observed through a scanning electron microscopy (SEM, Phenom ProX, China). Afterwards, the hydro
gel samples were trimmed into specific size with cutters for following mechanical tests. To assess the mechanical properties of TG-Cu hydrogels, uniaxial tensile tests and pressing tests were carried out on a universal material testing machine (Shimadzu AGS-X10KN, Japan) at room temperature. Furthermore, 10 000-time load-unload cyclic tensile test (strain=30%) of notched hydrogel sample was carried out to evaluate its fatigue resistance. The anti-bacterial performance of TG-Cu hydrogel against S. aureus and E.
coli was evaluated via the plate colony counting. Moreover, fluorescent live/dead stain test was conducted to determine the survival status of bacteria.
The chemical structure characterization confirmed the double network structure of the TG-Cu hydrogel: Cu2+ physically cross-linked alginate as the first network, MBAA chemically cross-linked PAAm as the second network.
Morphology observation showed TG-Cu's 3D network structure. The ideal dosage of GDL was proved to be 0.5 g per unit
(0.187 5 mol basic copper sulfate). The tensile tests of TG-Cu hydrogel indicated it had considerable mechanical strength,
its Young's modulus reached 22.4 kPa, toughness was 659.5 kPa. After 10 000-time cyclic load-unload experiments of the notched hydrogel sample, no obvious crack propagation can be seen, exhibiting excellent fatigue resistance of TG-Cu.
Through the antibacterial test, it was confirmed that the antibacterial rate of TG-Cu hydrogel against S. aureus and E. coli can reach more than 99%.
The Cu-crosslinked TG-Cu hydrogel not only guarantees the excellent mechanical properties of the material, but also endows it with specific function, realizing the organic unity of material structure design and functionality.
KEY WORDS: alginate; polyacrylamide; hydrogels; mechanical properties; antibacterial
水凝胶是以水为分散介质、以三维交联亲水高分子网络为骨架的软、湿材料，是一种典型的软物质，也是广义弹性体类型中的一种。水凝胶材料具有独特的生物相容性、理化性能，兼具固体和流体的特征，在多个领域展现出良好匹配性和适应性，例如生物医用材料[1-2]、传感与致动器件[3-4]、胶黏[5]、光学器件[6]、防污[7]和防腐[8]等领域，均被广泛研究。由于水凝胶本身具有软湿材料的质地，普遍存在力学性能较低的问题，因此成为阻碍其应用的短板。如何通过对凝胶网络骨架的设计，从而改善水凝胶的力学性能和疲劳性能是目前重要的研究方向之一。其中，以金属离子交联的海藻酸盐为第1层网络、以化
学交联的聚丙烯酰胺为第2层网络的强韧双网络水凝胶（Tough Gel，TG）在一定程度上解决了凝胶力学性能低的问题[9]。
海藻酸盐是一种天然高分子，其化学结构中富含羧基和羟基。这些基团既赋予其良好的亲水性，又为化学改性与络合金属离子提供了可能。金属离子的引入，可为凝胶带来抑菌功能。海藻酸盐与多种金属离子络合的课题已有多项研究与实践[10-14]，这些研究表明，不同金属离子与海藻酸盐会产生不同的亲和性，在二价金属离子中Cu2+具有较强的络合能力，且成本较低。
铜作为一种重金属，长久以来其抑菌作用已被人熟知。目前的研究表明，Cu2+主要采用干扰细菌细胞遗传物质和蛋白质结构等方式起到抑菌作用[15-16]。近期学者又提出了全新的铜离子载体诱导细胞凋亡的机制——铜死亡[17]。单纯铜离子的通用抑菌应用也是国内外学者感兴趣的研究课题之一。Borkow等[18]通过化学和物理手段将Cu2+引入一系列棉纤维和聚酯产品中，制备了具有Cu2+抗菌、抗螨功能的穿着用品
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及生活用品。经测试，浸渍的Cu2+织物和乳胶产品对多种微生物起到了抑制和杀灭作用。此外对鼠和兔的动物实验表明，浸渍Cu2+的抑菌产品不会导致皮肤过敏。铜基金属抑菌剂也常用于海洋抑菌防污，已有不少相关应用与研究[7]。
基于以上讨论，如果将Cu2+引入强韧双网络水凝胶的设计中，使其成为双网络凝胶骨架结构的一部分，同时融合其抑菌性能，做到凝胶结构性与功能性的交叉协同。文中拟将典型强韧双网络水凝胶中的Ca2+替换为Cu2+，制备一种兼具优秀力学性能和抑菌功能的凝胶。采用热引发水溶液聚合法制备双网络凝胶，设计并制备Cu2+离子交联的TG水凝胶（称为TG–Cu），探究制备TG–Cu水凝胶的合适条件。利用菌落计数、活死菌荧光染等手段探究不同条件下TG–Cu双网络水凝胶对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。这种水凝胶有望应用于可穿戴抑菌设备、海洋抑菌防污表面等领域。
1 实验
1.1 TG–Cu凝胶制备方法
实验所用主要试剂：海藻酸钠（SA）、N, N′–亚甲基双丙烯酰胺（MBAA）、过硫酸铵（APS）、D–(+)–葡萄糖酸δ–内酯（GDL），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙烯酰胺（AAm）、碱式硫酸铜[CuSO4·3Cu(OH)2]，上海麦克林生化科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED），东京化成工业株式会社。所有试剂均为分析纯。
将凝胶网络单体AAm与SA、交联剂MBAA按以下比例加入容器中：每50 mL去离子水中加入6.98 g AAm、1.16 g SA和3.36 mg MBAA。使用机械搅拌机将上述组分搅拌3 h，至完全溶解。向其中加入浓度为0.27 mol/L的热引发剂APS溶液，得到溶液A。在每955 μL去离子水中加入40 μL交联催化剂TEMED
和0.187 5 mol海藻酸盐网络交联剂碱式硫酸铜粉末，分散均匀，得到溶液B。每添加0.187 5 mol 碱式硫酸铜，额外添加0.5 g GDL，使碱式硫酸铜完全溶解。迅速混合溶液A和溶液B至均匀，避免出现气泡。在室温下静置8 h，让凝胶聚合过程在模具中进行，制备出TG–Cu凝胶，具体过程如图1所示。
用于红外测试的聚丙烯酰胺凝胶制备方法与上述TG–Cu的制备方法类似，仅添加了AAm、MBAA、APS和TEMED组分，经搅拌均匀后灌模。制备海藻酸铜水凝胶时，将SA、碱式硫酸铜粉末与GDL混合。
1.2 TG–Cu凝胶结构与形貌表征
将TG–Cu凝胶样品经冷冻干燥后取出，研磨成粉末，利用X射线能量散谱（EDS）、扫描电子显微镜（SEM）观察凝胶冻干样品的微观形貌结构。通过X 射线光电子能谱（XPS）手段分析了凝胶样品的化学结构，其中X射线源为微焦单MgKα（1 253.6 eV）。借助傅里叶变换红外光谱仪（FT–IR）获得了凝胶样品的红外谱图，扫描范围为500~4 000 cm−1。
1.3 TG–Cu/Ca凝胶的力学性能测试
在日本岛津公司AGS–X10KN万能试验机上进行力学性能测试，所用传感器的量程为50 N和500 N，测试环境为室温、空气中。所有样品均重复测试3次，
图1 TG–Cu凝胶的制备过程Fig.1 Preparation process of TG-Cu gel
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以保证复现性和稳定性。
拉伸试验采用哑铃型试样，应变速率为100 mm/min。压缩测试采用圆柱体试样，压缩速率为12 mm/min，最大压缩应变λ=75%。Mullins测试采用无缺口矩形样品，以应变速率100 mm/min分别拉伸至应变λ为25%、50%、75%、100%。循环加载测试（疲劳测试）采用带缺口矩形试样，拉伸至应变λ=30%后，立即回到初始位置，重复循环10 000次。
1.4 TG–Cu凝胶抑菌性能
凝胶的抑菌性能选择金黄葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌（ATCC25922）分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表进行测试，购于青岛日水生物技术有限公司。抑菌实验中的所有用具均预先用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，实验菌种操作均在超净台上进行。每20 h进行一次涂平板和菌落计数操作，共进行3次。根据先前报道的方法[19]，使用活/死菌荧光染试剂盒对细菌进行荧光染活/死细胞活力测试。
2 结果及分析
2.1 水凝胶制备过程
选择离子配位交联剂时，经比较发现，只能选用水中难溶的碱式硫酸铜，且需要调节pH，以溶出Cu2+。若pH的降低幅度太大、太迅速，不仅会出现成胶太快的情况，而且会影响凝胶的整体成胶性，
因此需要选择合适的pH缓释调节剂。将D–(+)–葡萄糖酸δ–内酯（GDL）溶于水后逐步水解，从而降低pH 值，是一种合适的pH缓释调节剂。
通过对比实验，探究了凝胶制备过程中每添加0.187 5 mol碱式硫酸铜对应的GDL合适添加量，分别制备了添加0.1、0.25、0.5、1 g GDL的凝胶样品。单轴拉伸和压缩试验结果表明，每添加0.187 5 mol碱式硫酸铜，对应添加0.5 g GDL时，凝胶样品呈现出最优的力学性能。力学测试结果（图2）表明，当GDL添加量过多时，同样会影响凝胶性能。分析原因可能是体系的pH值过低，羧基电离平衡向左移动，海藻酸盐分子链中大部分羧基被质子化，导致可用于与Cu2+络合的羧基大量减少[20]。这将影响凝胶材料的网络结构和交联密度，使凝胶材料的力学性能下降。从凝胶样品外观上看，与未添加GDL的样品相比，在该条件下制备的TG–Cu呈蓝透明状，无盐类粉末残留（如图2c所示），说明它已完全溶解。当GDL的添加量过小时，从凝胶外观上可以发现其内部有铜盐固体粉末残留，这将导致凝胶的力学性能受到影响。
2.2 水凝胶FI–IR分析
为了确定不同样品中存在的化学结构，进行了傅里叶变换红外光谱（FT–IR）测试，结果如图3所示。对于SA样品的光谱，在3 300 cm−1处的宽吸收峰可归因于羟基（—OH）的伸缩振动，在1 026 cm−1处的吸收峰对应C—O键的伸缩振动，而在1 600 cm−1和1 400 cm−1处的2个峰则为羧酸根（—COO−）的特征吸收。
PAAm和TG–Cu凝胶的谱图波形相似，表明它们具有相似的骨架。在3 340 cm−1和3 190 cm−1处出现的峰分别是伯氨基（—NH2）的不对称振动和对称伸缩振动，在2 930 cm−1处的吸收峰归因于亚甲基（—CH2—）不对称伸缩振动，伯氨基（—NH2）摇摆振动峰出现在1 120 cm−1处[21]。在1 665 cm−1处的吸收峰代表羰基（C==O）的伸缩振动（即酰胺I带），相邻的1 610 cm−1处的吸收峰对应氨基（—NH2）的弯曲振动（即酰胺Ⅱ带），并且在1 420 cm−1处可以观察到氨基的伸缩振动峰（即酰胺Ⅲ带）。通过酰胺Ⅰ—Ⅲ带这3个重要吸收带的组合[22]，可识别样品中的伯酰胺基团（—CONH2）。另外，与 PAAm 样品的谱图相比，TG–Cu凝胶谱图中1 026 cm−1处对应C—O 键伸缩振动的吸收峰更加突出，这证实了水凝胶中海
图2 不同GDL添加量下凝胶样品的应力–应变曲线和样品照片
Fig.2 Stress-strain curves of gel samples with different GDL dosage and optical pictures of the samples:
a) process of stretching; b) process of compression; c) photograph of the sample with 0.5 g GDL
(left) and the sample without GDL (right)
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图3 海藻酸钠、聚丙烯酰胺和TG–Cu
凝胶的红外光谱
Fig.3 FT-IR spectra of SA, PAAm and TG-Cu
藻酸盐的引入。此外，还可以观察到TG–Cu凝胶样品谱图中—NH2的伸缩振动吸收峰略微向低波数偏移。这是由于引入海藻酸盐网络后，体系中形成了更多的氢键。
2.3 水凝胶SEM分析
TG–Cu凝胶样品的SEM图像（图4）展现出凝胶典型的三维网络结构。水凝胶中原本占据大部分空间的水分被去除后，只有聚合物骨架被保留下来。尽管在冻干过程中骨架结构可能会发生部分坍塌，但SEM图像仍保留了骨架原有的孔洞形态。从EDS图像中可以确定，TG–Cu水凝胶网络中存在和分布着C、N、O、Cu 4种元素。可以观察到4种元素均匀分布在立体网络中，尤其是Cu元素，它作为海藻酸盐网络交联剂被引入凝胶结构中。这可以证明PAAm 网络和海藻酸盐网络的互穿结构。
2.4 水凝胶XPS分析
TG–Cu凝胶的XPS谱如图5所示。C 1s谱图中有3个峰：位于284.78 eV处的峰对应C—H键信号，在286.
李民基28 eV处的峰对应海藻酸盐吡喃环上的C—O—C 结构。C 1s谱图中位于288.08 eV处的峰，以及N 1s 谱图中位于399.40 eV处的单峰，分别代表PAAm结构中酰胺侧基（N—C==O）上的C和N。O 1s谱图在531.08 eV处和532.26 eV处有2个峰，分别对应C—O和C==O结构。在Cu 2p谱图中出现的2个峰位于932.56 eV和952.33 eV，分别与Cu(HCOO)2结构中Cu 2p3/2和Cu 2p1/2信号匹配。该结构由Cu2+与海藻酸盐的羧基交联形成，可证实Cu2+的配位交联。
基于以上对TG–Cu凝胶样品的化学与物理表征，可以阐明水凝胶样品具有化学交联PAAm网络和离子交联海藻酸盐双网络结构，且Cu2+在其中起到了离子交联剂的作用，与预期一致。
2.5 水凝胶力学性能
基于上述合适的GDL与碱式硫酸铜的用量比例，探索了凝胶中铜盐添加量对凝胶力学性能的影响，结果如图6所示。在保持GDL添加比例的情况下，分别探究了2倍、1.5倍、0.75倍和0.5倍铜盐添加量时凝胶的力学性能。从凝胶样品单轴拉伸结果来看，当Cu2+的添加量增至2倍时，凝胶模量得到明显提升，达到52.9 kPa，但同时凝胶材料的脆性增强，在拉伸过程的塑性形变区断裂，呈现脆性断裂特征。当Cu2+的添加量减少为0.5倍时，凝胶模量明显下降，为5.9 kPa，变得软而弱，能承受的最大应力也降低，对应的压缩曲线（图6c）也表现出同样的趋势。由此可见，保持合适的Cu2+添加量，可从力学性能方面保证TG–Cu凝胶具有合适的力学性能，延长材料的服役时效。
TG–Cu凝胶样品在拉伸应力–应变曲线上表现出明显的屈服现象。在拉伸试验中，可观察到拉伸试样的颈缩现象，呈现类似于结晶高聚物拉伸时产生的颈缩，不同的是应力–应变曲线在屈服点后仍在上升。该力学过程可通过双网络凝胶的网络结构特点解释[23]。Cu2+交联的海藻酸盐是TG–Cu凝胶的第1层网络，通过共价键化学交联的PAAm构成了第2层网络。当凝胶样品开始受到拉伸时，相对脆弱的离子键和配位键先被破坏，原本交联在一起的海藻酸盐分子链部分出现分离，形成样品的宏观形变。在到达材料屈服点后，第2层网络开始与部分解交联的第1层网络同时承受载荷。化学交联不同于动态的配位交联，强度更高，因此PAAm网络开始被拉伸，产生应变。
图4 TG–Cu凝胶SEM、EDS图像和元素分布
Fig.4 SEM, EDS images and element distribution of TG-Cu gel
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