王清媛
重庆大学硕士学位论文
信用卡进度查询（学术学位）
学生姓名：高军平
指导教师：夏庆友教授
专业：生物学
学科门类：理学
重庆大学生命科学学院
二O一三年四月
Cloning and Functional Analysis of Carotenoid Cleavage Dioxygenase Gene in
Nicotiana tabacum
A Thesis Submitted to Chongqing University
in Partial Fulfillment of the Requirement for the
Master‘s Degree of Science
赵薇被泼粪By
Gao Junping
Supervised by Prof. Xia Qingyou
Specialty：Biology
College of Life Science of
Chongqing University , Chongqing, China
April 2013
中文摘要
好听的笔名摘要制氮气
类胡萝卜素（Carotenoid）是烟草中一种重要的萜烯类化合物。新鲜烟叶中的类胡萝卜素主要有叶黄素、新黄质、紫黄质和β-胡萝卜素，它们在烟草的生长、烤制和调制过程中起着重要的作用，其含量不仅与烟叶的光泽、泽相关，也影响着烟叶的香味品质。类胡萝卜素裂解的产物是烟叶致香的重要成分，包括紫罗兰酮、大马酮等，这些物质香味阈值很低、刺激性小、对香味贡献比较大。
类胡萝卜素双加氧裂解酶（Carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）是一类能在不同双键处裂解植物中不同类胡萝卜素的酶，产物为脱辅基类胡萝卜素。这些物质有些参与植物的生长发育过程的调节，如脱落酸和独脚金内酯；有些是花和果实颜、风味及香味成分，如具有经济价值的红木素、藏红花苷，阈值很低的香味成分β-紫罗兰酮、香叶基丙酮等。CCDs是一个古老的基因家族，目前发现有九个成员，活性区域具有很强的保守性，其中CCD1主要作用于类胡萝卜素的9-10/9‘-10‘ 、C5-C6 ⁄C5‘-C6‘和C7-C8 ⁄C7‘-C8‘双键处，分别生成C13β-ionone、C8 6-methyl-5-hepten-2-one和C10 geranial。
本文以栽培烟草品种沙姆逊（Samsun）为材料克隆NtCCD1和NtCCD4基因，并对其序列和功能进行分析研究，结果如下：
代表友谊的花（1）烟草中有两个NtCCD1（NtCCD1A和NtCCD1B）基因和一个NtCCD4基因。多序列比对表明NtCCD1和NtCCD4蛋白含有多个保守域和实现功能必须的4个组氨酸，它们都是水溶性蛋白。NtCCD
1催化生物反应的场所在细胞质，NtCCD4定位在质体上。三维结构预测表明目的蛋白由4个α螺旋，30个β折叠片以及一些无规则卷曲组成，预测结果与玉米VP14蛋白的三维结构相似。qRT-PCR 检测烟草不同组织中NtCCD1和NtCCD4的表达情况，结果表明除了NtCCD1B基因，NtCCD1A基因和NtCCD4基因在根、茎、叶和花中均有表达，NtCCD4在叶中的表达量最高，其次是花中；NtCCD1A在叶和花中的表达量比较高，然而NtCCD1B在根中几乎不表达。
（2）构建NtCCD1基因的原核表达载体，诱导后能够表达可溶性的融合蛋白，大小为80KDa左右。在通过基因工程技术改造能合成番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素的菌株中诱导NtCCD1蛋白表达，与对照比较，菌体的颜放生了明显的变化，浅红、黄和浅黄消失或变淡，说明NtCCD1蛋白能裂解番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄素。提取诱导目的基因表达后合成β-胡萝卜素的菌体中素，用HPLC测定峰值，β-胡萝卜素消失，进一步说明了NtCCD1的裂解功能。
（3）采用农杆菌介导方法转化烟草，得到T0代转基因苗，收获种子并获得
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