文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）02－0376－05·论著·
凝血功能的影响
王瑞娟，王兆钺*，江明华，张威，曹丽娟，孙雄华，张剑，白霞，阮长耿苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室，江苏苏州215006
摘要本研究旨在观察巴曲亭及其有效成分的止血机理及对出血性疾病凝血功能的影响。采用全自动血凝仪检测巴曲亭及其有效成分巴曲酶与凝血因子Ⅹ激活物（FⅩA）对正常人及出血性疾病患者血浆的活化部分凝血活酶时间（APTT）与凝血酶原时间（PT）的影响，用发底物法检测FⅩA、巴曲酶及巴曲亭对凝血因子Ⅹ（FⅩ）活化及凝血酶生成的影响。结果表明：巴曲亭及其有效成分可以缩短正常人血浆的APTT，其中FⅩA缩短APTT的作用在一定浓度范围内存在量效关系（r=0．889，P＜0．05）。FⅩA、巴曲酶及巴曲亭可纠正出血性疾病患者APTT 的延长，三者对PT无明显影响。FⅩA能促进FⅩ的活化及凝血酶的生成，巴曲酶及巴曲亭对二者无明显作用。
结论：巴曲亭有明显的促进凝血效果，并可纠正出血性疾病的止血异常，其有效成分巴曲酶直接作用于纤维蛋白原，而FⅩA通过活化FⅩ促使凝血酶的生成。
关键词巴曲亭；凝血作用；出血性疾病
中图分类号R554文献标识码A
in vitro Effects of Hemocoagulase Atrix and Its Effective Components on Blood Coagulation of Patients with Bleeding Disorders
WANG Rui-Juan，WANG Zhao-Yue*，JIANG Ming-Hua，ZHANG Wei，CAO Li-Juan，SUN Xiong-Hua，ZHANG Jian，BAI Xia，RUAN Chang-Geng
Key Laboratory of Thrombosis and Hemostasis Subordinated to Ministry of Health，Jiangsu Institute of Hematology，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou215006，Jiangsu Province，China
*Corresponding Author：WANG Zhao-Yue，Professor．Tel：（0512）67780872．E-mail：zwang11@sina．com
Abstract This study was aimed to investigate the procoagulation effects of hemocoagulase atrix and its effective components（batroxobin and factorⅩactivator）on plasma of normal subjects and patients with bleeding disorders and their mechanisms．Activated partial thromboplastin time（APTT）and pro
thrombin time（PT）were measured．The factor（F）Ⅹactivation and thrombin generation were analyzed by using chromogenic substrate method．The results showed that the plasma APTT of normal subjects was shortened by hemocoagulase atrix，batroxobin and FⅩactivator，and the effect of FⅩactivator was found to be concentration-dependent（r=0．889，P＜0．05）．The prolonged APTT of plasma from patients with bleeding disorders could be corrected by hemocoagulase atrix，batroxobin and FⅩactivator，but PT showed no great changes resulted from the treatments．FⅩactivator could promote FⅩactivation and thrombin generation，while neither hemocoagulase atrix nor batroxobin showed such abilities．It is concluded that hemocoagulase atrix promotes coagulation process，and corrects coagulation abnormalities in patients with bleeding disorders，its main component batroxobin directly acts on fibrinogen，and FⅩactivator promotes thrombin generation through activating FⅩ．
Key words hemocoagulase atrix；coagulation；bleeding disorder
J Exp Hematol2012；20（2）：376－380
凝血过程是由一系列的丝氨酸蛋白酶及其辅因子参与的网络酶促放大反应。组织因子（tissue factor，TF）表达于受损伤或受刺激的细胞（内皮细胞或单核细胞），与循环中的凝血因子Ⅶ（coagulation fact
orⅦ，FⅦ）结合形成FⅦ-TF复合物，激活FⅨ与FⅩ，使凝血酶原变为凝血酶，后者通过内源性凝血途径的正反馈作用，将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。出血是一种常见的临床表现，外伤、手术及一些出血性疾病常常引起大量出血，甚至威胁到患者的生命。蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类，有些酶类作用于血液凝固酶促级联反应过
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号81070395）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）
*通讯作者：王兆钺，教授，博士生导师．电话：（0512）67780872．E-mail：zwang11@sina．com
2011－10－25收稿；2011－11－04接受
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·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2012；20（2）：376－380
程中的一个或多个环节，可激活FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ或直接使纤维蛋白原凝集［1－8］。很多蛇毒成分已用于出血或血栓性疾病的诊断和［9，10］。蛇毒类凝血酶（thrombin-like enzyme，TLE）
为丝氨酸蛋白酶，是蝮亚科蛇毒中一个具有促凝血活性的组成成分，能直接作用于纤维蛋白原，促进血液凝固［8］。不同来源的蛇毒类凝血酶对血浆纤维蛋白原的作用方式不同。根据类凝血酶作用于纤维蛋白原所得产物不同将其分为3类：①只释放纤维蛋白肽A，即SVTLE-A，如巴曲酶（bathroxobin）；②只释放纤维蛋白肽B，即SVTLE-B，如铜头蝮蛇毒类凝血酶（trimeresu-rus okinavensis）；③既释放纤维蛋白肽A又释放纤维蛋白肽B，即SVTLE-AB，如巴西窝面蝰蛇毒（B．jararacussu venom）［11］。巴曲亭（hemo-coagulase atrix，注射用蛇毒血凝酶）为巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）毒液中分离出来的止血成分，包括2种有效成分：巴曲酶和少量FⅩ激活物（FⅩactivator，FⅩA）。巴曲酶直接作用于纤维蛋白原Aα链Arg16-Gly17处，释放纤维蛋白肽A后形成纤维蛋白单体Ⅰ，但不降解纤维蛋白B肽，亦不直接激活FⅩⅢ，因此不能形成稳定的纤维蛋白。FⅩA可以直接激活FⅩ，从而激活凝血酶原，使纤维蛋白原降解成纤维蛋白，并激活FⅩⅢ，形成稳定的纤维蛋白。巴曲亭已广泛用于神经外科、妇科与骨科手术，以及消化道与呼吸道出血，临床上有较满意的止血效果［12－15］，但有关实验研究资料较少，至今尚无对出血性疾病的方面的实验研究。
材料和方法
实验对象
根据知情同意原则，留取20名健康志愿者（年龄20－45岁，男女各半）的3．8%柠檬酸钠抗凝血浆。血
友病A患者25例，维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者7例，血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）患者3例，FⅩ缺乏症患者3例，血友病B、FⅤ缺乏症、FⅦ缺乏症与纤维蛋白原缺乏症患者各1例。血浆分装后在－20ħ条件下保存备用。
主要试剂及仪器
巴曲亭（产品批号1003172）、巴曲酶与FⅩA由蓬莱诺康药业有限公司提供；人血浆FⅩ为Calbiochem公司产品；发底物S-2337、S-2222为美国Sigma公司产品；活化FⅩ（FⅩa）标准品及人凝血酶标准品为Hyphen BioMed公司产品。STAGO COMPACT全自动血凝仪为法国Stago公司产品，全波长多功能酶标仪为赛墨飞世尔科技实验室产品，KDC-40低速离心机为北京东南仪诚实验室设备有限公司产品。
活化部分凝血活酶时间（APTT）与凝血酶原时间（PT）检测
在正常人血浆及出血性疾病患者血浆中分别加入一定浓度的FⅩA、巴曲酶或巴曲亭，37ħ温育3min 后在全自动血凝仪上检测APTT和PT，并与空白对照组（加入等量生理盐水）比较（APTT参考值范围为28－40s，PT参考值范围为11－14．5s。）
血浆FⅩ活化及凝血酶生成的发底物法检测
S-2337和S-2238分别为FⅩa及凝血酶特异性发底物，被水解后释放出生基团对硝基苯胺，后者的
释放量与FⅩa及凝血酶的活力成正比，在405nm 波长处检测吸收峰。
取血浆或FⅩ（8μg/ml）100μl，加入100μl FⅩA溶液〔FⅩA0．002U/ml，Tris-HCl100mmol/L （pH7．5），CaCl
2
6mmol/L，盐酸苯甲醚2mmol/L〕，37ħ温育5min，吸取100μl加入96孔酶标板中，再加入100μl发底物缓冲液〔S-23370．625mg/ ml，Tris-HCl0．5mmol/L（pH8．3），EDTA25 mmol/L，NaCl375mmol/L〕，在405nm波长处检测其吸光度值30min［16］。取血浆100μl，加入FⅩA（0．1U/ml）溶液1μl，37ħ温育5min后吸取10μl点于96孔酶标板中，再加入96μl发底物缓冲液（S-22382mmol/L，EDTA5mmol/L，盐酸
苯甲脒50μmol/L，CaCl
2
3mmol/L），在405nm波长处检测其吸光度值30min［17］。
统计学处理
运用SPSS16．0软件进行统计学分析，计量资料数据以珔XʃSD表示，根据实验结果分别采用组间t检验和自身配对t检验，P＜0．05为有统计学显著性差异。
结果
巴曲亭及其有效成分对凝血的影响
FⅩA、巴曲酶及巴曲亭均能缩短正常人血浆的APTT；随着浓度的增大，缩短APTT的作用越明显，其中FXA的作用在一定浓度范围内存在量效关系（r=0．889，P＜0．05）。FⅩA浓度为0．0005U/ml、巴曲酶及巴曲亭在浓度为0．05U/ml时可使正常人血浆的APTT缩短10s左右（图1，2）。三者对正常人血浆PT均无明显影响（P＞0．05，表1）。
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巴曲亭及其有效成分对出血性疾病患者凝血功能的影响
巴曲亭及其有效成分对出血性疾病止血异常的作用当F ⅩA 浓度＞0．0005U /ml 、巴曲酶及巴曲亭浓度＞0．05U /ml 时，可完全纠正血友病A 患者血浆APTT 的延长（图1，2）。因此，在出血性疾病的实验研究中选用以上的F ⅩA 、巴曲酶与巴曲亭浓度。实验结果表明，巴曲亭及其有效成分可完全纠正血友病A 、血友病B 、维生素K 依赖性凝血因子缺乏
症、
F Ⅴ缺乏症与VWD 患者血浆APTT 的延长，F Ⅹ缺乏症（F Ⅹ活性为3%）患者APTT 的延长也能明
显缩短（P ＜0．001，
表2），而对无纤维蛋白原血症患者血浆的APTT 无明显影响（P ＞0．05）。F ⅩA 、巴
曲酶及巴曲亭不能纠正F Ⅴ、F Ⅶ、F Ⅹ缺乏症、维生
素K 依赖性凝血因子缺乏症患者与无纤维蛋白原血症患者PT 的延长（表1）。
巴曲亭及其有效成分对F Ⅹ活化的影响
F ⅩA 可以活化纯化的F Ⅹ或正常人血浆中的F Ⅹ，
曲婉婷怎么了且随着F ⅩA 浓度的增加，
F Ⅹa 的浓度也相应升高（r =0．889，P ＜0．05），但因FX 未被完全活化，故FXa 的浓度低于F Ⅹ的浓度。对部分出血性疾病，
如血友病A 、血友病B 与vWD 患者，
F ⅩA 可明显使其血浆中的F Ⅹa 升高（P ＜0．05），
而对F Ⅹ缺乏症患者及维生素K 依赖性凝血因子缺乏症患者却不能使血浆F Ⅹa 明显升高（P ＞0．05）。巴曲酶及
巴曲亭对F Ⅹ无明显活化作用（P ＞0．05，表3、
4）。Table 1．Effect of F ⅩA ，batroxobin and hemocoagulase atrix on PT of plasma from normal subjects and patients with bleeding disorders
Group
PT （s ）
Control F ⅩA （0．0005U /ml ）Batroxobin （0．05U /ml ）Hemocoagulase Atrix （0．05U /ml ）Normal subjects （n =20）12．9ʃ0．2512．6ʃ0．1712．8ʃ0．1912．5ʃ0．20Vitamin K deficiency （n =7）71．4ʃ36．873．6ʃ35．572．6ʃ34．773．2ʃ37．16F Ⅹdeficiency （n =3）
35．9ʃ6．58
33．2ʃ5．23
33．25ʃ8．00
34．4ʃ9．05
Table 2．Effect of F ⅩA ，batroxobin and hemocoagulase atrix on APTT of plasma from patients with bleeding disorders
Group
APTT （s ）
Control FXA （0．0005U /ml ）Batroxobin （0．05U /ml ）Hemocoagulase Atrix （0．05U /ml ）HA （n =25）
90．7ʃ26．528．5ʃ4．73＊＊＊21．3ʃ4．65＊＊＊19．8ʃ5．01＊＊＊Vitamin K deficiency （n =7）99．4ʃ46．646．0ʃ13．1＊＊34．5ʃ12．6＊＊＊37．7ʃ13．3＊＊＊F Ⅹdeficiency （n =3）93．5ʃ34．929．6ʃ1．27＊＊＊34．4ʃ7．78＊＊＊33．9ʃ8．55＊＊＊vWD （n =3）
50．3ʃ2．13
31．4ʃ1．86＊＊＊
34．7ʃ2．30＊＊＊
32．4ʃ1．78＊＊＊
HA ：hemophilia A．vWD ：von willebrand disease．＊＊
P ＜0．01，＊＊＊P ＜0．001，compared with control．
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873·中国实验血液学杂志J Exp Hematol 2012；20（2）
Table3．Effect of batroxobin and hemocoagulase atrix on plasma FⅩactivation（FⅩa）and thrombin
gener-ation of plasma from normal subjects
Concentration （U/ml）
FⅩa
（μg/ml）
FⅩA+FⅩFⅩA+P
Thormbin
（IU/ml）
FⅩA+P
Control0．0041780．03093512．8237 FⅩA0．00010．0351290．062483175．0282 0．00050．0811560．266835219．2182
0．0010．2023400．356429223．3971
0．0050．6428160．535582307．9681
0．051．0912490．730677339．9861 Batroxobin0．05No linear correlation0．03453634．8140 Hemocoagulase atrix0．05No linear correlation0．03748417．9736 P：normal plasma．
Table4．Effect of FⅩA（0．0005U/ml）on plasma F Ⅹand thrombin generation of patients with bleeding disorders
Group
FⅩa（μg/ml）
Control FⅩA
Thrombin（IU/ml）
Control FⅩA
HA0．04100．55656．6581725．3969 HB0．01280．606558．9755949．6521
FⅦdeficiency0．00930．23142．4651708．0378
FⅩdeficiency0．00660．01281．9829283．1121 vWD0．01370．38568．8743704．5878 Vitamin K
deficiency0．01540．01728．0152129．3869 HA：hemophilia A；HB：hemophilia B．
巴曲亭及其有效成分对凝血酶生成的影响
FⅩA可明显促进正常人血浆中凝血酶的生成，但与FⅩA浓度无明显线性相关关系（P＞0．05）。对血友病A、血友病B、vWD、FⅩ缺乏症患者及维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者，FⅩA亦能明显促进其凝血酶生成（P＜0．05）。巴曲酶及巴曲亭对正常人血浆及出血性疾病患者的凝血酶生成作用不明显（P＞0．05，表3、4）。
讨论
巴曲亭及其有效成分巴曲酶与FⅩA能缩短正常人APTT，并可完全纠正多种出血性疾病患者APTT的延长，显示有促进止血作用。对正常人PT无明显影响，且不能纠正FⅤ、FⅦ、FⅩ缺乏症、维生素K 依赖性凝血因子缺乏症患者与无纤维蛋白原血症患者的PT的延长，这是由于检测PT的试剂中含有一定量的肝素，而巴曲亭及其有效成分不能拮抗肝素的抗凝作用（未发表资料）。FⅩA激活FⅩ，其作用强度与浓度呈正相关（r=0．889，P＜0．05）。FⅩA 还可活化凝血酶原，但与FⅩA浓度无明显线性相关关系（P＞0．05）。我们还发现，FⅩA对乏FⅩ血浆无作用，证明FⅩA对其他凝血因子无直接激活作用。FⅩ缺乏症与维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者FⅩ的浓度很低，此时FⅩA的作用明显减弱。巴曲酶不作用于FⅩ，不能激活FⅩ与凝血酶原。巴曲亭中仅含有少量FⅩA，尚不足以激活FⅩ与凝血酶原，主要
依靠巴曲酶发挥止血作用，低剂量的FⅩA仅具有加强止血的效果。
目前临床有明显效果的止血药物不多，主要包括：1-去氨基-8-D精氨酸加压素（DDAVP）通过促进血管内皮细胞释放血管性血友病因子与提高血浆FⅧ水平，主要用于轻、中度甲型血友病及1型vWD 的；抗纤溶药物（氨甲苯酸与氨甲环酸等）抑制纤维蛋白的水解，主要用于手术创伤、体外循环、肝脏疾病或肿瘤等引起的纤溶亢进或原发性纤溶活性过强所引起的出血；凝血因子制剂（如人凝血因子Ⅷ与凝血酶原复合物等）常作为替代和补充疗法，防治相应凝血因子不足所致的出血。基因重组的活化FⅦa主要用于有抗FⅧ抗体的血友病A及FⅦ缺乏症患者，但对外伤性出血无确定效果［18］，且价格昂贵。巴曲亭已在临床证实有止血效果。本研究发现，巴曲亭可纠正血友病、vWD的止血异常，提示可成为出血性疾病新的药物，但对无纤维蛋白原血症患者无效。从药理作用及实验结果看，巴曲亭不适用于无纤维蛋白原血症、纤溶亢进及弥散性血管内凝血引起的出血。
止血与血栓形成是一个动态平衡，止血药物往往有一定的致血栓危险。巴曲亭中仅含有少量FⅩA，不足以激活FⅩ与凝血酶原。巴曲酶本身并不能诱导血小板聚集和释放反应，但在外源性的纤维蛋白原存在下能使血小板聚集，这种效应能完全被抗血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa）单克隆抗体或抗GPⅠb单克隆抗体所抑制。巨大血小板综合征患者的洗涤血小板即使在外源性纤维蛋白原存在的情况下，对巴曲酶也无反应，提示巴曲酶与血小板结合部位是GPⅠb，而不是凝血酶受体［19］。巴曲酶的主要作用是水解纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体Ⅰ，形成的纤维蛋白不牢固（未发表资料），对体内的纤溶酶较敏感
［20］，易受其分解，只有暂时的止血效果，故在剂量范围内不引起血栓形成。研
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巴曲亭及其有效成分对出血性疾病患者凝血功能的影响
究结果表明，巴曲亭在一些出血性疾病引起的出血上有很好的应用前景。
致谢：蓬莱诺康药业有限公司惠赠部分试剂，在此深表谢意！
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