[收稿日期]2022-08-20 [修回日期]2023-03-03[基金项目]内蒙古自治区自然科学基金项目(2021MS08158)
[作者简介]庄 妍(1996-)，女，硕士研究生.
[通信作者]孟 峻，博士，硕士研究生导师，主任检验师.E⁃mail:nmfrank@163
[文章编号]1000⁃2200(2024)02⁃0152⁃05
㊃基础医学㊃
庄 妍1，任丽芳2，韩 迪1，孟 峻3
(1.内蒙古医科大学第一临床医学院，内蒙古呼和浩特010000;2.内蒙古自治区人民医院检验科,
内蒙古呼和浩特010000;3.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特010000)
[摘要]目的：探讨沉默信息调节蛋白2(SIRT2)在小鼠1⁃细胞期受精卵的表达和定位㊂方法：利用qRT⁃PCR㊁Western blotting 分别检测SIRT2在小鼠1⁃细胞期受精卵发育全过程中mRNA 和蛋白表达谱；采用细胞免疫荧光法观察SIRT2和α⁃tubulin 的共定位情况㊂结果：小鼠1⁃细胞期受精卵SIRT2mRNA 和蛋白表达变化
趋势一致，均由G 1向G 2期过渡时表达水平升高；由G 2期向M 期过渡时表达水平下降(P <0.05)㊂在G 2期向M 期过渡过程中,SIRT2的定位由细胞质向细胞核转移，于M 期中期进入细胞核并定位于纺锤体，在M 期后期重新定位于细胞皮质㊂结论:SIRT2蛋白在小鼠1⁃细胞期受精卵中的表达呈细胞周期时相依赖性，在1⁃细胞期小鼠受精卵有丝分裂间期(G 1㊁S㊁G 2)中细胞质内表达增加，积累的SIRT2在某种条件下进入细胞核调节纺锤体微管动力学，在G 2/M 过渡期发挥作用㊂
[关键词]1⁃细胞期受精卵；有丝分裂；沉默信息调节蛋白2；表达；亚细胞定位
[中图法分类号]Q 2 [文献标志码]A DOI :10.13898/jki.issn.1000⁃2200.2024.02.003
Expression and localization of SIRT2in the 1⁃cell stage of mouse zygote
ZHUANG Yan 1,REN Lifang 2,HAN Di 1,MENG Jun 3
(1.The First Clinical Medical College ,Inner Mongolia Medical University ,Hohhot Inner Mongolia 010000;2.Clinical
Laboratory ,The People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region ,Hohhot Inner Mongolia 010000;
3.Clinical Laboratory ,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University ,Hohhot Inner Mongolia 010000,China )[Abstract ]Objective :To investigate the expression and subcellular localization of sirtuins 2(SIRT2)in the mouse 1⁃cell stage zygote.Methods :The mRNA and protein expression profiles of SIRT2in the development of mouse 1⁃cell stage zygote were detected by qRT⁃PCR and Western blotting.The co⁃localization of SIRT2and α⁃tubulin was observed by cell immunofluorescence method.Results :In the mouse 1⁃cell stage zygote,the expressions of SIRT2at mRNA level had consistency with protein level.The expression level was increased during the transition from G 1phase to G 2phase,and decreased during the transition from G 2phase to M phase.During the transition from G 2phase to M phase,the localization of SIRT2was gradually shifted from the cell cortex to the nucleus and localized in the spindle in the mid⁃M phase,when in the late M phase,it relocated to the cell cortex.Conclusions :The expression of SIRT2protein
in mouse 1⁃cell stage zygote is cell cycle phase⁃dependent.The expression of SIRT2protein increases in the cytoplasm of mouse 1⁃cell stage zygote mitotic interphase (G 1,S,G 2),and the accumulated SIRT2regulates the dynamics of spindle microtubules under some
certain condition and plays a role in the G 2/M transition.
[Key words ]1⁃cell stage zygote;mitosis;sirtuins 2;expression;subcellular localization
细胞周期是产生细胞生物学活动的基本过程，主要包括间期1(G 1)㊁DNA 合成期(S)㊁间期2(G 2)和有丝分裂期(M)㊂深入研究细胞周期机制不仅能够辅助体外受精(in vitro fertilization,IVF)进展，还有助于逆转癌症代谢和恢复癌症的免疫监视[1-2]，小鼠卵母细胞和受精卵细胞往往作为观察细胞周期的良好模型㊂近年来,MAHDESSIAN 等[3]使用荧光
泛素化细胞周期指标(FUCCI)技术，通过在单个细胞水平上对细胞周期中的单个细胞进行精确的人类蛋白质组学综合图谱分析，进一步验证了大多数细胞周期蛋白的翻译后调节是推动细胞周期循环的关键因素㊂
沉默信息调节蛋白(Sirtuins)是一类烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD +)依赖性酶，通过多个下游靶
标的去乙酰化和其他翻译后修饰影响不同的细胞发育过程，包括转录沉默㊁DNA重组和修复㊁细胞凋亡和细胞代谢[4]㊂根据蛋白结构和酶活性的差异，人源Sirtuin蛋白可分为1~7种亚型，其中SIRT2是唯一定位于细胞质，且具有强NAD+依赖脱乙酰基酶活性的Sirtuin亚型[5],SIRT2的乙酰化调节是细胞周期进程的重要影响因素㊂SIRT2是主要的组蛋白去乙酰化酶，维持核小体结构稳定和正常组装，保证机体代谢稳态和DNA正常转录[6]㊂在细胞正常分裂过程中，微管蛋白的NAD依赖性乙酰化由SIRT2介导㊂在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中, RASSF1A调节SIRT2和HDAC6介导的微管蛋白乙酰化以形成正常形态的纺锤体，确保染体的正常排列[7]㊂由此笔者认为SIRT2在细胞周期进程中发挥重要作用㊂然而关于SI
RT2蛋白在小鼠受精卵发育中的表达与定位情况尚鲜见报道，因此本课题组以小鼠1⁃细胞期受精卵为模型，采用qRT⁃PCR和Western blotting技术分别从转录水平和蛋白水平检测SIRT2在小鼠1⁃细胞期受精卵G1㊁S㊁G2和M四期中的表达；利用细胞免疫荧光技术检测SIRT2与α微管蛋白(α⁃tubulin)在小鼠1⁃细胞期受精卵中的共定位情况，初步阐述SIRT2与小鼠1⁃细胞期受精卵的关系，探究SIRT2在小鼠早期胚胎有丝分裂中的作用机制㊂
1 材料与方法
1.1 实验动物
本实验所用昆明系SPF级小鼠购于内蒙古医科大学实验动物中心，均于恒温恒湿(温度25~ 27℃，湿度保持在50%~52%范围)动物房内饲养㊂其中雌性小鼠，培育时间为4~6周，体质量20~25g；雄性小鼠，培育时间8周及以上，体质量35~45g㊂
1.2 实验试剂
孕马血清促性腺激素(宁波三生)；人绒毛膜促性腺激素(赤峰博恩)；透明质酸酶㊁M16培养液㊁矿物油(Sigma);RNAfast200⁃总RNA极速提取试剂盒(上海飞捷生物);One⁃Step gDNA Removal试剂盒(全式金),qPCR试剂盒(全式金);Anti⁃SIRT2 antibody,Anti⁃βactin antibody(SantaCruz biotechnology);HRP⁃con
jugated Goat Anti⁃Rabbit IgG (北京中杉);ECL化学发光试剂盒(Piece Biotechnology);FITC⁃Alexa Fluor594Affinipure Donkey Anti⁃Rabbit IgG,FITC⁃Alexa Fluor488 Affinipure Donkey Anti⁃goat IgG(proteintech)㊂1.3 小鼠受精卵的采集和培养
准备4~5周龄昆明系SPF级雌性小鼠40只，在动物房照明条件明暗交替㊁温度湿度条件适宜的情况下继续培育1周㊂根据前文所述[8]进行小鼠超数排卵㊂在以上工作完成后，于当日18:00将完成超排卵的雌性小鼠与在相同条件下培养,8~12周龄的昆明系SPF级雄性小鼠1∶1合笼过夜㊂次日清晨8:00检栓，若雌鼠出现阴栓则视为受精成功㊂将带有阴栓的雌性小鼠采用脱颈椎法处死，取出两侧输卵管放入0.9%氯化钠溶液液滴中㊂在体式显微镜下，利用1mm注射器刺破输卵管壶腹部膨大处，使受精卵-卵丘细胞复合物流出，随后将以上细胞团放入含有0.3%透明质酸酶中的M16培养液中，去除受精卵周围附着的卵丘细胞㊂将洗净裸卵放入提前加入M16和矿物油的培养皿中，置于恒温恒湿CO2培养箱中培养㊂据此研究[9]确定各期受精卵的收集时间㊂
1.4 qRT鄄PCR
分别取200个左右G1㊁S㊁G2和M期1⁃细胞期受精卵放于不同离心管中，密封保存，按照RNAfast200⁃总RNA极速提取试剂盒说明书提取mRNA；利用紫外分光光度计对提取的mRNA进行吸光度检测，计算260nm与280nm波长下吸光度的比值，比值在1.8~2.0范围内，表明提取的mRNA纯度高，可以进行RT⁃
PCR㊂经实验测得该批次提取的mRNA纯度高，可进行下一步实验处理，准备1μL提取的mRNA㊁4μL5×TransScript All⁃in⁃One SuperMix㊁1μL gDNA Remove㊁14μL Free⁃RNAse水，依次加入到反应试管中混合均匀，反应条件为42℃15min,85℃5s完成体外反转录㊂按照TransScript试剂说明书进行q⁃PCR来检测SIRT2 mRNA的含量，引物序列见表1，反应体系见表2㊂反应条件:94℃预变性30s,94℃5s,60℃15s,45个循环;95℃15s,56℃30s,95℃15s,1个循环㊂
表1 引物序列
引物名称序列
SIRT2⁃F5′⁃GGA ACC CTT CTT TGC CCT TG⁃3
SIRT2⁃R5′⁃AGC GTG TCT ATG TTC TGC GTG T⁃3 Actin⁃F5′⁃CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C⁃3 Actin⁃R5′⁃ATG GAG CCA CCG ATC CAC A⁃3
1.5 Western blotting
宋小睿真实长相取G1㊁S㊁G2和M四个时相的小鼠1⁃细胞期受精卵200个，按常规方法提取受精卵中的总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白置于提前加热的100℃水浴锅煮沸7~10min㊂将变性蛋白与适量buffer混合稀释成适合的浓度，与marker分别加入十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶点样孔内，每孔30μL㊂完成点
样后，进行电泳㊂于70V30min㊁120V60min的条件下跑胶㊂随后将凝胶取出，置于冰盒内4℃转膜2h，将条带转移至NC膜上㊂随后用5%脱脂奶粉室温封闭1h；将封闭处理的NC 膜加入按1∶1000稀释的Anti⁃SIRT2antibody和Anti⁃βactin antibody中,4℃孵育过夜㊂第2天将NC膜移入1∶1000HRP⁃conjugated Goat Anti⁃Rabbit IgG中，在室温条件下孵育2h㊂随后使用TBST溶液对含有目的条带的NC膜进行脱，重复3次，每次20min㊂按说明书加入ECL化学发光试剂，利用Bio⁃Rad显微成像系统，以β⁃actin为内参，分析蛋白质相对表达水平㊂
表2 qPCR反应体系
名称试剂用量
目的基因1μL
正向引物(10μmol/L)0.4μL
反向引物(10μmol/L)0.4μL 2×TransStart Tip Green qPCR预混液10μL
ROX相关染液(50×)0.4μL
无酶水7.8μL
总体系20μL 1.6 细胞免疫荧光共定位
取1⁃细胞期G1㊁S㊁G2㊁M四个时相和即将进入2⁃细胞期G1期的受精卵用PBS洗液处理3遍，以去除细胞表面的透明带㊂向处理后的受精卵中加入适量的4%多聚甲醛固定，在室温条件下放置1h；完成后加入PBST溶液将上述样品洗涤3次，每次处理时间为5min；最后用0.1%Triton X⁃100透化，打孔30min㊂PBS(含5%BSA)封闭液封闭1h㊂将处理完成的受精卵转入一抗，在4℃条件下处理5min，再洗涤3次；将处理后的受精卵转入二抗中，在室温条件下避光处理，放置时间为1h；再洗涤3次，之后用Hoechst33258对上述样品进行染处理，静置时间为10min，使核酸染㊂在激光共聚焦扫描显微镜下，观察SIRT2和α⁃tubulin在受精卵中的定位及核酸染情况，根据α⁃tubulin和核酸分布可确认纺锤体和染质位置，从而确认M期进程㊂
1.7 统计学方法
采用方差分析和q检验㊂
2 结果
2.1 SIRT2在小鼠受精卵早期发育进程中表达谱 结果显示:S组㊁G2组㊁M组与G1期SIRT2 mRNA表达水平相比,S组和G2组高于G1组,G2组高于S组和M组，差异均有统计学意义(P<0.05); SIRT2在1⁃细胞期
受精卵的四个时期(G1㊁S㊁G2㊁M 期)的蛋白相对表达水平,S组和G2组高于G1组, G2组高于M组，差异均有统计学意义(P<0.05) (见表3㊁图1)㊂SIRT2蛋白与其mRNA的表达变化趋势一致，在G1期最低，从G1向G2过渡时持续增加，于G2期达到峰值，随后向M期过渡时降低㊂
表3 1⁃细胞期受精卵的SIRT2mRNA和蛋白表达水平(x±s)时期n SIRT2mRNA SIRT2蛋白表达
G12000.781±0.0050.632±0.018
S200 1.362±0.010*0.709±0.017*
G2200 1.812±0.006*△0.863±0.019*△
M2000.919±0.008*△#0.650±0.014#
F 7752.6778.34
P <0.01<0.01
MS
组内 0.6510.034
q检验：与G1比较*P<0.05；与S组比较△P<0.05；与G2比较#P<0.
05
2.2 SIRT2和α⁃tubulin在小鼠1⁃细胞期受精卵各期的共定位情况
在转染的小鼠1⁃细胞期受精卵中，可见红荧光标记的SIRT2与绿荧光标记的α⁃tubulin定位一致㊂结果发现,SIRT2在G1期定位于细胞皮质且表达强度最弱(见图2A)，随着受精卵由G1期向G2期过渡,SIRT2逐渐由细胞皮质区域向细胞质转移，表达强度也随之增强，在G2早期表达强度达到最强峰(见图2B㊁2C)；而当受精卵由G2向M期过渡时，部分SIRT2入核向染质凝集区聚集，在细胞质内表达强度逐渐减弱(见图2D)，根据α⁃tubulin和染体的分布情况，入核的SIRT2和M中期纺锤体定
位一致(见图2E)；随着M 期结束，在向2⁃细胞期转变过程中，纺锤体消失，染质移向两极,SIRT2在受精卵重新定位于细胞皮质区域(见图2F㊁G㊁H)㊂
推测SIRT2在某种条件下完成了核质穿梭并参与G 2/M 转换㊂在小鼠1⁃细胞期受精卵细胞周期中,
SIRT2
的亚细胞定位呈现出纺锤体动力学依赖性㊂3 讨论
受精卵的有丝分裂停滞和及时恢复是哺乳动物
有丝分裂的基本步骤㊂在酵母和甲壳类生物中,SIRT2是参与有丝分裂的关键蛋白质，在细胞周期
时相转化中发挥重要作用[10-11]㊂在酵母细胞中,SIRT2通过和PR⁃Set7相互作用，在有丝分裂G 2/M 转换期中参与表观遗传标记H4K20me1的建立，从而影响S 期进展和基因组稳定性[12]㊂SIRT2缺陷动物则表现出基因组不稳定性和染体畸变，肿瘤
易感性也随之增加[13-14]㊂而在哺乳动物受精卵中, SIRT2是否同样能够影响有丝分裂进程，目前相关研究较少㊂
本课题组通过qRT⁃PCR㊁Western blotting技术，证明SIRT2在小鼠1⁃细胞期受精卵细胞周期进程中存在，且SIRT2mRNA和SIRT2蛋白的表达在细胞周期中呈时相依赖性变化㊂研究[15-16]表明，有丝分裂中纺锤体的形成与SIRT2修饰的微管蛋白的去乙酰化至关重要㊂在小鼠胚胎成纤维细胞中，当细胞处于G2/M过渡期时,SIRT2通过核质穿梭调节组蛋白H4Lys16(H4K16Ac)脱乙酰化，从而调节染体浓缩[17]㊂因此我们利用SIRT2和α⁃tubulin细胞免疫荧光共定位，发现在小鼠1⁃细胞期受精卵中，与常规亚细胞定位不同,SIRT2在有丝分裂期G2/M 转化时由细胞质进入细胞核定位于纺锤体㊂我们推测在小鼠1⁃细胞
期受精卵的G2/M转换期中,SIRT2在某种条件下通过核质穿梭调节纺锤体微管的动力学和动粒的功能，从而帮助实现有丝分裂间期向分裂期的转变㊂
综上所述,SIRT2在小鼠1⁃细胞期受精卵有丝分裂不同时相中存在表达差异和定位变化，或许能够作为哺乳动物受精卵细胞有丝分裂恢复的新的调节因子，这对于更好地理解有丝分裂的调控具有重要意义㊂由于实验条件限制，本课题组无法使用电镜观察中心粒的亚细胞定位，对于检测SIRT2在1⁃细胞期受精卵的纺锤体组装过程中的作用有待补充㊂在后续实验中，我们将通过构建SIRT2表达质粒，过表达或沉默SIRT2后，观察小鼠1⁃细胞期受精卵发育状态；筛选SIRT2蛋白下游的染质蛋白及与靶蛋白具体的作用位点，进一步证明SIRT2对1⁃细胞期受精卵的正向调控作用，确认SIRT2是否能够作为受精卵G2/M转换期检测点以检测细胞周期进程㊂
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(本文编辑 刘璐)
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