生物技术进展
２０１６年㊀第６卷㊀第２期㊀１３０~１３６
ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１
进展评述
Ｒｅｖｉｅｗｓ
㊀
收稿日期:２０１５￣１１￣１１ꎻ接受日期:２０１５￣１１￣２６
㊀
作者简介：孙亚军ꎬ本科生ꎬ研究方向为生物工程ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｕｎｙａｊｕｎ４３＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者：蔡俊ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事微
生物发酵工程研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｃａｉｊｕｎ＠ｍａｉｌ.ｈｂｕｔ.ｅｄｕ.ｃｎ
滚环扩增技术最新研究动态及展望
孙亚军ꎬ㊀王㊀亮ꎬ㊀蔡㊀俊∗
湖北工业大学工程技术学院ꎬ发酵工程教育部重点实验室ꎬ武汉４３００６８
摘㊀要：滚环扩增技术(ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＲＣＡ)的建立模拟了自然界中环状病原生物ＤＮＡ通过滚环模型方式自我复制的原理ꎬ经长期科学研究和实践应用ꎬ取得了诸多突破性成果ꎮ对最近几年在滚环扩增技术研究领域的最新动态进行了较全面的总结ꎬ其中包括了网状ＲＣＡ㊁锁式探针ＲＣＡ㊁目标成环ＲＣＡ和跨越式ＲＣＡꎬ也对滚环扩增中存在的问题进行了探讨ꎬ重点介绍了该技术在基础研究㊁实际检测㊁医疗诊断及纳米材料等方面的应用ꎬ最后对核酸等温扩增技术产业化的发展前景进行了展望ꎮ
关键词:ＲＣＡꎻ纳米材料ꎻ转基因ꎻ锁式探针ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０２.０９
ＰｒｏｇｒｅｓｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓｏｆＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＳＵＮＹａ￣ｊｕｎꎬＷＡＮＧＬｉａｎｇꎬＣＡＩＪｕｎ∗
ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｌｌｅｇｅꎬＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＷｕｈａｎ
４３００６８ꎬＣｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｍｕｌａｔｅｓｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｓｅｌｆ￣ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｎｇ￣ｓｈａｐｅｄｐａｔｈｏｇｅｎ
ＤＮＡｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅｍｏｄｅｌｉｎｎａｔｕｒｅꎬｅｘｐｅｒｉｅｎｃｉｎｇｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｍａｎｙｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓｈａｖｅｂｅｅｎａｃｈｉｅｖｅｄ.Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｍａｄｅａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｓｕｍｍａｒｙｏｎｔｈｅｌａｔｅｓｔｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｏｎｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ(ＲＣＡ)ꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｅｔＲＣＡꎬｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅＲＣＡꎬｔａｒｇｅｔｃｉｒｃｌｅＲＣＡａｎｄｓｔｒｉｄｅＲＣＡ.Ｔｈｅｐａｐｅｒａｌｓｏｄｉｓｃｕｓｓｅｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ.ＷｅｍａｉｎｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＣＡｉｎｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈꎬｔｈｅｐｒａｃｔｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎬｍｅｄｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＮａｎｏ￣ｍａｔｅｒｉａｌｓ.Ａｔｌａｓｔꎬｔｈｅｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｔｏｗａｒｄｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｗａｓｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＲＣＡꎻｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎻｔｒａｎｓｇｅｎｅꎻｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅ
㊀㊀建立于２０世纪９０年代中期的滚环扩增技术(ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＲＣＡ)
ꎬ模拟了自然界中环状病原生物ＤＮＡ通过滚环模型方式进行自我复制的原理ꎬ在研究初期就得到了世界范围内科研人员的高度关注ꎮ经过不断研究和改善ꎬ现已成为了包括ＤＮＡ链置换扩增(ＳＤＡ)㊁环介导的等温扩增(ＬＡＭＰ)和依赖解旋酶的恒温基因扩增(ＨＤＡ)等核酸恒温扩增技术中的重要一员ꎮ与传统的核酸扩增技术相比ꎬＲＣＡ技术摆脱了对精良仪器的依赖和进行反复热变性等缺点的局限ꎬ且有较高的灵敏度和特异性ꎬ反应时间也相对缩
短ꎬ使得以此项技术为基础的核酸扩增检测技术能更有效的投入到普遍和成规模的实际应用中ꎮ通过对目前国内外在滚环扩增技术中的研究及应用调查发现ꎬ相较国外ꎬ我国的ＲＣＡ应用研究还是有些不足ꎬ因此本文对最近几年国内外在滚环扩增技术研究领域的最新动态进行了较全面的总结ꎬ对滚环中存在的问题进行了探讨ꎬ介绍了该技术在基础研究㊁实际检测㊁医疗诊断及纳米材料等方面的应用[１ꎬ２]ꎬ以期为我国科学研究中ＲＣＡ技术的广泛应用提供参考ꎮ
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１㊀ＲＣＡ技术
最早对ＲＣＡ技术的研究包括了线性ＲＣＡ(即单引物ＲＣＡꎬ又叫ＬＲＣＡ)㊁指数ＲＣＡ(即双引物ＲＣＡꎬ也被称为超分支滚环扩增ꎬＨＲＣＡ)㊁多引物ＲＣＡ和免疫ＲＣＡ等[３ꎬ４]ꎮＲＣＡ技术操作的基本原理是在ＤＮＡ聚合酶作用下ꎬ引物沿着环状模板链延伸和扩增ꎬ产物为与单环模板序列完全相同的线性链ꎬ但长度却扩大了数千倍[５]ꎮ随着ＲＣＡ技术的发展ꎬ研究者在这几种比较基础的ＲＣＡ技术上不断改善㊁创新ꎬ开发了一批更加高效和实用的ＲＣＡ技术ꎬ其中就包括了如网状ＲＣＡ㊁锁式探针ＲＣＡ㊁目标成环ＲＣＡ和跨越式ＲＣＡ在内的一系列ＲＣＡ技术ꎮ
１.１㊀网状ＲＣＡ
在ＬＲＣＡ和ＨＲＣＡ的基础上建立的网状ＲＣＡ(ｎｅｔｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＮＲＣＡ)是引入了切刻内切酶的一种更高效率的核酸扩增技术ꎬ切刻内切酶可识别双链中特定的核苷酸序列ꎬ并只切割双链中的一条单链ꎮ其在ＬＲＣＡ阶段的产物上设计了一个切刻内切酶的酶切位点ꎬ切割下的单链与环状ＤＮＡ模板互补并充当引物ꎬ从而继续诱发ＬＲＣＡ和ＨＲＣＡ反应ꎬ使其在ＬＲＣＡ和ＨＲＣＡ基础上实现了进一步的扩增ꎬ扩增产物的原子力显微表征显示为结构较为单一的网状结构ꎮ如果把ＬＲＣＡ产物视为树干ꎬ那么ＨＲＣＡ就是具有众多枝桠的一棵完整大树ꎬＮＲＣＡ则是发展为由无数棵大树组成的茂密森林(图１)[６]ꎮ与ＬＲＣＡ和ＨＲＣＡ相比ꎬ该技术一方面没有牺牲原有技术在操作性㊁使用成本和扩增所需时间等方面的优势ꎬ另一方面其在原有技术基础上进一步实现了信号放大ꎬ从而为更低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件[６]ꎮ
１.２㊀锁式探针ＲＣＡ
经特异性生成环状ＤＮＡꎬＨＲＣＡ和ＬＲＣＡ都可用于线性ＤＮＡ的扩增ꎬ即只有目标ＤＮＡ存在的条件下ꎬ另一条线状ＤＮＡ才可成环ꎬ且只有成环的线状ＤＮＡ才可以进行复制和扩增ꎬ为了进一步保证此反应的特异性ꎬ可采用双切口滚环扩增[７]ꎮ线状探针ＤＮＡ的长度只有几十个碱基ꎬ两端能与目标ＤＮＡ一段连续的序列相结合ꎬ
在探针
图１㊀ＬＲＣＡ㊁ＨＲＣＡ和ＮＲＣＡ对比示意图[６]
Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅＬＲＣＡ㊁ＨＲＣＡａｎｄＮＲＣＡｃｏｎｔｒａｓｔｓ
ｉｎｄｉａｇｒａｍ[６].
两端序列之间留一段缺口ꎬ通过在缺口处设计既能发挥探针功能又能行使引物作用的一段序列ꎬ且当另一部分探针和设计的引物序列都和模板完全互补配对后ꎬ两个切口才能被连接酶特异性连接成环ꎬ也只有这种由两部分探针形成的环状模板才能在两条引物作用下扩增ꎮ这个方法类似于将线状ＤＮＡ分子特异性地锁定在目标ＤＮＡ上ꎬ可以很好的应用在单核苷酸特异性基因诊断的研究中[８]ꎮ
１.３㊀目标成环ＲＣＡ
目标成环ＲＣＡ(ｔａｒｇｅｔｃｉｒｃｌｅＲＣＡꎬＴＣ￣ＲＣＡ)克服了锁式探针ＲＣＡ的单链探针不稳定㊁探针与模板容易错配㊁扩增产物并非目标序列而是互补探针自身等缺点ꎮ用限制性内切酶酶切样品ꎬ产生具有９ｎｔ粘性末端的序列ꎬ其次ꎬ设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头ꎬ经连接酶的作用ꎬ同目标序列连接成环ꎬ然后再利用具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶ꎬ在两条引物的作用下引发ＨＲＣＡꎬ最后ꎬ扩增产物再经过限制性内切酶酶切ꎬ得到扩增后的目的片段ꎮＴＣ￣ＲＣＡ能在无背景信号的条件下扩增目标ＤＮＡ片段ꎬ同时接头能
１３１孙亚军ꎬ等：滚环扩增技术最新研究动态及展望
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稳定结合于固相磁珠表面而不影响扩增ꎬ因此能在芯片上实现目标成环等温扩增ꎮ在此基础上ꎬ利用高特异性的ＤＮＡ连接酶㊁生物素修饰接头㊁链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段ꎬ构建了磁珠辅助的ＴＣ￣ＲＣＡ技术ꎮ该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列ꎬ从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系ꎬ在检测食品中的有害微生物方面十分适用[９]ꎮ
１.４㊀跨越式ＲＣＡ
通过具有链置换活性及热稳定性的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶引入ＲＣＡ反应所提出的跨越式滚环等温扩增(ｓｔｒｉｄｅＲＣＡꎬＳＲＣＡ)ꎬ对ＲＣＡ反应中所产生的背景信号机理提供了线索ꎬ其原理和过程与早期指数ＲＣＡ和多引物ＲＣＡ类似ꎬ但由于ＢｓｔＤＮＡ聚合酶具有在聚合过程中不受ＤＮＡ缺口影响的特殊活性ꎬ当核酸合成过程中遇到复制模板缺空后可跨越并继续合成延伸ꎬ因此ꎬＳＲＣＡ能够以非闭合环形ＤＮＡ为模板启动扩增反应ꎮＢｓｔＤＮＡ聚合酶最开始以上游引物为模板合成其互补链形成双链ＤＮＡ后ꎬ该酶发挥核苷酸转移酶活性在其引物的３ᶄ末端沿５ᶄң３ᶄ方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸序列ꎬ即ＤＮＡ的合成反应跨越了互补链与下游引物间的缺口ꎬ以下游引物为模板继续互补配对ꎻ然后ＢｓｔＤＮＡ聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到下游互补序列的３ᶄ末端后形成寡聚核苷酸序列ꎬ继续催化聚合反应合成互补新链ꎬ完成一轮合成ꎻ最后ꎬ通过其链置换酶活力替换上一轮引物ꎬ往复进行滚环扩增ꎬ从而形成
重复扩增产物ꎮ通过该特性设计的非闭合模板ꎬ巧妙设计引物ꎬ避免了引物之间的扩增ꎬ该技术能很好的驱动ＲＣＡ反应ꎬ为基于ＲＣＡ技术的检测方法及开发提供了新的理论依据和借鉴意义ꎬ也对开发等温扩增技术检测微生物有一定帮助[１０]ꎮ
２㊀ＲＣＡ技术的应用
ＲＣＡ技术在基础研究㊁实际检测㊁医疗诊断及纳米材料等方面都有很好的应用ꎬ结合细胞原位检测㊁单核苷酸多态性(ＳＮＰｓ)㊁蛋白质分析㊁免疫芯片和全基因组的扩增等研究都能发挥其巨大的优势[１１~１４]ꎬ而且弥补了相应技术中存在的某些不足ꎬ例如在细胞原位检测中避免了传统原位ＰＣＲ技术扩增产物会扩散出细胞的问题ꎬ且恒温扩增特性保证了组织形态学特征的完整性[１５]ꎻ在单核苷酸多态性检测中可以在合适的反应环境和探针设计条件下同步检测多组等位基因[１６]ꎬ甚至还实现了对极低丰度基因组ＤＮＡ样本的检测ꎻ近来研究显示ＲＣＡ技术对ｍｉＲＮＡ的检测也非常灵敏和高效[１７ꎬ１８]ꎮ当前ＲＣＡ技术越来越多的应用到更多的领域ꎬ充分证明了其重要的价值ꎮ２.１㊀蛋白质分析免疫芯片检测
对于一些疾病的检测诊断和定向对药物药靶的筛选已通过免疫芯片技术得到了部分优化ꎬ但对于进行高通量及高灵敏性的检测是传统信号扩增检测力所不及的ꎬ基于ＲＣＡ技术的免疫芯片检测不仅克服了这一缺陷ꎬ而且使芯片靶点间的空间独立性和抗原抗体结合体的整体性得到了保证[１９ꎬ２０]ꎬ基于两者技术的交叉结合对于实现如数百个目标分子同时检测这样的成规模生产大有裨益ꎬ还可以将微阵列技术与免疫ＲＣＡ结合以实现多元高通量并行分析蛋白质ꎮ
Ｍｉｌｌｅｒ等[２１]制成能检测前列腺癌患者及健康人血清中蛋白的１８６中抗体芯片ꎬ对患者与健康人中表达差异蛋白成功进行了筛选ꎮＺｈｏｕ等[２２]用不同标记素双ＲＣＡ芯片对血清蛋白质进行了相对水平的检测ꎬ验证了其信号强度相对于间接和直接标记检测法大幅提升ꎬ比诸如ＨＬＩＳＡ法等方法的检测过程中具有更高的重复性与准确性ꎮ近年来ꎬ免疫ＲＣＡ技术与纳米材料相结合还可用于蛋白质的高灵敏度甚至超高灵敏度检测[２３]ꎮＯｕ等[２４]通过ＤＮＡ封装脂质体发展的免疫ＲＣＡ多功能分析平台对于超灵敏检测蛋白质十分实用ꎮＣｈｅｎｇ等[２５]也提出了一种高灵敏性的级联信号放大蛋白质分子检测策略ꎬ该策略融合了ＲＣＡ㊁功能化量子点㊁生物素－亲核素系统和电化学溶出伏安检测技术ꎮ
２.２㊀ＲＣＡ全基因组扩增
对于分子生物学的研究ꎬ核酸的扩增无疑是最重要的手段之一ꎬ在对较大的环状ＤＮＡ模板的研究中ꎬ例如噬菌体ＤＮＡ㊁叶绿素ＤＮＡ和质粒等[２６]ꎬ采取指数ＲＣＡ技术对模板的扩增能达到均一和全面的效果[２７]ꎮＲＣＡ技术也拓展应用到
２３１生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.
了全基因组的扩增(ＷＧＡ)ꎬ有研究报道ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶和核酸酶抗性引物在３０ħ温育６ｈ条件下ꎬ应用ＲＣＡ技术能够从少至１０个拷贝的基因组中扩增ＤＮＡ至２０~３０μｇꎬ产物的平均长度大于１０ｋｂꎮ因此ꎬ采用ＲＣＡ技术可以实现利用全血样品扩增人类基因组ＤＮＡ的目标[２８]ꎮＷａｎｇ等[２９]开发了一种全新的限制性环化ＲＣＡ(Ｒ
ＣＡ￣ＲＣＡ)ꎬ这是一种改进的全基因组扩增技术ꎬ可针对于出现了明显降解和交联的ＤＮＡ样品ꎮ此方法用限制性内切酶将ＤＮＡ降解成短片段后环化成ＤＮＡ环状单链ꎬ最后进行ＨＲＣＡꎮＮｉｅｌ等[３０]利用ＲＣＡ可以由多条引物引发的特点ꎬ从人血浆样品中对细环病毒(Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ)的全基因组进行扩增ꎬ由于四条引物同时使用ꎬ使得所有成环扩增子扩增几率更加均等ꎬ每个片段都可以扩增到３０ｋｂ以上ꎬ样品均一ꎬ覆盖率在９０％以上ꎮ
２.３㊀转基因检测及食品安全
转基因植物及其产品正不断涌入人们的生活ꎬ引起了世界范围对于食品安全性的广泛关注ꎬ因此ꎬ对于转基因植物检测技术的需求显得迫切重要ꎮＲＣＡ技术用于植物转基因成分的检测相比传统的ＰＣＲ方法检测和ＥＬＩＳＡ等方法具有更加方便㊁高效的优点ꎮ陶震等[３１]通过效仿复合式ＰＣＲ原理采用复合式ＨＲＣＡ方法成功的对转基因烟草进行了检测ꎬ并取得了理想的结果ꎮ通过食物中提取转基因模板ꎬ锁式探针再与其特异性杂交成环ꎬ之后进行ＲＣＡ反应扩增[３２]ꎬ能够应用于进出口食品中转基因成分的快速而高效检测中ꎮ食品中卵清蛋白的检测也可基于抗体抗原结合的特异性ꎬ利用ＲＣＡ技术来进行扩增[３３]ꎮ还有研究者把食物中重金属铅的检测结合ＲＣＡꎬ利用Ａｐｔａｍｅｒ特异性结合Ｐｂ２＋后ꎬ判断目标物的存在与否[３４㊁３５]ꎮ张健[３６]利用ＲＣＡ技术对食源性致病微生物进行了特异性检测ꎬ例如副溶血性弧菌㊁单核增生李斯特氏菌等ꎬＲＣＡ检测体系还可以研制成试剂盒以更方便的进行快速㊁高灵敏性及准确性的检测[３７]ꎮ
２.４㊀ＲＣＡ在纳米技术中的应用
２.４.１㊀ＤＮＡ纳米结构合成㊀ＲＣＡ可用于合成特定的ＤＮＡ纳米结构ꎬ在体外模拟复杂的ＤＮＡ复制ꎮ建立人工ＤＮ
Ａ纳米材料已成为研究热点ꎬ而ＲＣＡ重复串联产物序列是能够通过编码其环状模板来实施精确调控的[３８]ꎬ因此ꎬ基于这点特性可与人工合成ＤＮＡ纳米结构技术相结合ꎮ现已成功把ＲＣＡ技术用于与端粒酶六聚体核苷酸序列互补的一个环状模板复制ꎬ来人工合成及制备人端粒酶ꎬ对于人工合成端粒酶在活体研究中的意义重大ꎮＬｉｎ等[３９]利用ＲＣＡ技术成功复制出平行互换ＤＮＡ分子(ｐａｒａｎｅｍｉｃｃｒｏｓｓｏｖｅｒＤＮＡꎬＰＸＤＮＡ)ꎬ建立了人工ＤＮＡ纳米结构ꎬ表明ＲＣＡ能够作为复制其他复杂ＤＮＡ纳米结构的有效工具ꎬ为将来核酸药物的发展提供了方法ꎮ
利用具有链置换作用及高持续合成力的Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶在ＲＣＡ进程中不会受到模板自身二级结构约束的性质ꎬ如双链㊁发卡㊁结头等这些在功能化核酸和ＤＮＡ纳米技术中的关键部分二级结构可通过ＲＣＡ技术合成ꎮ研究者们把基于ＲＣＡ扩增的放大合成用于ＤＮＡ四通接头结构上ꎬ提出了用于大尺寸树枝状ＤＮＡ接头制备的新策略ꎮ在对交联度较高的复杂ＤＮＡ纳米结构ＲＣＡ反应放大后ꎬ对胞内病毒ＤＮＡ克隆提供了一个新的可能途径ꎮＮａｎｇｒｅａｖｅ等[４０]通过ＲＣＡ实现了经单链ＤＮＡ分子构建的ＤＮＡ四面体－三维纳米结构的放大合成ꎮ
２.４.２㊀构建周期性纳米组装结构㊀因ＲＣＡ反应所具有的在扩增反应中通过聚合酶聚合核苷酸结合到引物末端而不断延伸扩增的特性ꎬ通过简便的环状序列长度的调节ꎬ就能精确地实现对组装单元间距的调节与控制ꎬ所以对于一维周期性纳米组装结构的构建ꎬＲＣＡ产物所特有的重复串联结构就理想的成为其模板ꎮ
Ｄｅｎｇ等[４１]和Ｂｅｙｅｒ等[４２]以重复串联核酸序列为模板ꎬ通过对有互补序列金纳米颗粒的杂交修饰ꎬ成功构建了有序的周期性金纳米颗粒组装结构ꎮＺｈａｏ等[４３]利用巯基修饰ＲＣＡ过程中的引物ꎬ修饰成功的引物与金纳米颗粒
lisa多高进行组装后进行ＲＣＡ反应ꎬ扩增得到的重复串联单链ＤＮＡ作为模板就可用于ＤＮＡ修饰的小尺寸纳米颗粒的组装ꎬ这是基于ＲＣＡ技术构建的一种新型的三维周期性纳米组装支架ꎮＣｈｅｇｌａｋｏｖ等[４４]和Ｗｉｎｎｅｒ等[４５]以ＲＣＡ产物分别作为支架及拉链状结构成功构建了三维ＤＮＡ纳米结构和可控尺寸的ＤＮＡ纳米管ꎬ还通过ＲＣＡ反应对于核酸适体的放大特性构建了周期性的蛋白质和纳米颗粒的复合纳米
３３１孙亚军ꎬ等：滚环扩增技术最新研究动态及展望
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结构ꎮ当延着ＲＣＡ产物长链连续性组装的四边形或六边形基本单元所合成的二维片层达到一定尺度后就会发生卷曲变性ꎬ这种变性导致了具有一定尺寸的ＤＮＡ纳米管的形成ꎮＨａｍｂｌｉｎ等[４６]也将ＲＣＡ反应的重复串联ＤＮＡ大片段作骨架很好的运用在了三棱柱ＤＮＡ纳米结构的构建上ꎬ经一系列构建的产物深度分析后发现这种结构对于核酸酶的降解抵抗力和结构稳定性大幅提升ꎬ还可有效的被癌细胞摄取ꎮ
３㊀ＲＣＡ技术存在的问题和解决策略
３.１㊀锁式探针连接效率
核酸链结构㊁离子强度和杂交温度等都是可制约及干扰核酸分子杂交的因素ꎬ在ＲＣＡ反应中的锁状探针的杂交及其连接的效率也是一个关键性的制约因素ꎬ只有确保了探针分子的杂交及高效的连接才会有高灵敏度和特异性的检测效果[４７]ꎮ
王星宇[９]设计的目标成环ＲＣＡ(ＴＣ￣ＲＣＡ)提高了探针与模板配对的正确率和稳定性ꎮＳｚｅｍｅｓ等[４８]的研究发现ꎬ热循环法对于核酸
分子的杂交有很高的效率ꎬ通过此项技术辅助锁状探针的杂交ꎬ保证了高效率的杂交后对马铃薯晚疫病原的成功分析ꎮ除此之外ꎬ不同的连接酶所要求的连接条件及连接效率有着较大的差异ꎬ包括锁式探针的小二级结构等也影响着反应的进程ꎮ根据相关报道ꎬＮａＣｌ浓度干扰着Ｔ４ＤＮＡ连接酶的保真性ꎬ当浓度处于５０~１５０ｍｍｏｌ/Ｌ之间时ꎬ此酶的保真性会随着ＮａＣｌ浓度的升高而不断增加ꎮ因此ꎬ必须要按照不同的实验设计来调控合适的连接条件及连接酶种类的选择ꎬ这样才能提高连接酶的连接效率及保真性ꎬ从而加强检测的灵敏性ꎮ
３.２㊀背景信号干扰
ＲＣＡ扩增反应的背景信号干扰问题一直以来都是严重干扰检测效率的一个棘手问题ꎬ背景信号的来源广泛ꎬ既有连接反应中非特异性连接经过多个循环扩增后产生的较强信号ꎬ又有未经成环的锁式探针等的干扰[４９]ꎬ因此ꎬ如何解决背景信号的干扰显得至关重要ꎮ孟兆祥等[１０]利用热稳定的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶驱动跨越式滚环扩增反应为ＲＣＡ反应中的背景信号干扰问题提供了线索ꎬ对于背景信号干扰的降低或消除ꎬ目前有几种主要方法:①通过无模板的阴性对照实验来确定背景信号的来源ꎬ经不同的荧光染料在ＲＣＡ反应与芯片分析中作标记后进行双重荧光芯片分析ꎬ能够极大限度的提升对背景信号和阳性信号区分的准确性ꎻ②筛选及弃除非特异性模板和未成环的锁式探针ꎬ可通过利用固体支持物上固定的生物素和抗生物素蛋白捕获探针和纯化探针来进行特异选择ꎬ但这也增大了ＲＣＡ技术的繁琐性及成本ꎻ③对未结合探针的模板和线性探针采用核酸外切酶降解ꎬ以克服未成环探针的背景信号对信号检测的干扰ꎮ
３.３㊀拓扑结构的制约
研究显示当ＤＮＡ单链分子通过互补配对与锁状探针杂交后会导致与拓扑结构相类似的区域结构形成ꎬ一旦产生这种结构就会严重干扰聚合酶对锁状探针的扩增[５０]ꎬ所以基于锁状探针的ＲＣＡ扩增分子检测手段的可行性饱受研究学者们的质疑ꎮ通过Ｂｅｙｅｒ等[５１]研究设计的一种特殊的锁式探针(ｅａｒｒｉｎｇｐｒｏｂｅ)在与ＤＮＡ分子退火杂交后ꎬ可自发形成特定的拓扑结构ꎬ再通过具有特殊链置换功能的ＢｓｔＤＮＡ聚合酶扩增杂交后的环状锁式探针ꎬ从而获得ＲＣＡ产物ꎬ研究结果表明即使不对模板进行变性处理ꎬＲＣＡ反应也会正常发生ꎬ从而很好的解决了所质疑的问题ꎮ解决了拓扑结构对扩增反应的制约ꎬ为ＲＣＡ技术在癌基因的检测㊁基因分型㊁单核苷酸多态性等广泛的核酸检测领域夯实了理论基础ꎮ
４㊀展望
生物技术产业作为２１世纪最有潜力的高新技术产业ꎬ是继信息产业后的又一个新兴经济技术增长点ꎬ在社会和经济可持续发展中具有战略性和先导性ꎮＲＣＡ作为生物技术中的一名重要成员ꎬ因其具有独特的等温扩增条件ꎬ克服了ＰＣＲ反应需要反复温度变化的循环过程ꎬ其优势也使得它对仪器的要求大大简化ꎬ反应时间大大缩短ꎬ检测灵敏度高ꎬ检测特异性强ꎬ同时也易于同其他技术联合ꎬ实现高通量与自动化检测ꎬ因此具有巨大的商业价值和广阔的市场潜力ꎮ但同时国内的ＲＣＡ发展也面临诸如研究资金来源单一㊁
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