血检四项化学发光法调查
一．化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型
类型 | 原理及试剂 | 发光类型 |
化学发光 免疫分析 （CLIA） | 用化学发光物质直接标记抗原或抗体组成 | 吖啶酯 （acrydinum esters） |
化学发光 酶免疫分析 （CLEIA） | 不用化学发光物直接标记免疫制剂。在酶免疫分析完成后加入化学发光底物，产生化学发光 | 1.辣根过氧化物酶(HRP)/H2O2/Luminol系统；1. 2.碱性磷酸酶(AP)/1，2二氧乙烷稳定衍生物（AMPPD）系统 |
电化学发光 免疫分析 （ECLIA） | 应用电致化学发光标记物与电化学手段相结合产生化学发光的免疫分析 | 三联吡啶钌（Rucbpy）32+ 三丙胺氨系统 |
微粒子酶联免疫 （MEIA）* | 微粒子作为载体，标记酶催化底物产生荧光 | 碱性磷酸酶作用于4_ 甲基磷酸伞型酮生成4-甲基伞型酮(MU)，MU产生出荧光，其荧光生成速率与被测物浓度相关。 |
时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）* | 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物 | 铕（ Eu3+ ）、 铽（ Te3+ ）及钐（ Sm3+ ）、 镝（ De3+ ） |
注：* 严格意义上属于荧光免疫。
二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：
表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家
厂家 | 仪器 | 特点 |
BECKMAN | ACCESS/ACCESS2 | 激素全球最好。速度较慢，肿瘤证不全 |
ROCHE | Elecsys 2010/1010 | 项目比较全，速度比较快。试剂成本比较贵。 |
Abbott | Axsym/ i2000/i4000 | 药物浓度最好。消耗大，启动慢 |
Bayer | ACS 180/ADVIA centaur | 速度比较快，但是故障高，维修成本贵 |
国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况
公司 | 仪器 | 试剂 |
北京源德生物 | 自有仪器 | 封闭试剂（HBsAg，无文号） |
北京泰格科信 | 自有仪器（MP180，MP 280） | HBsAg |
北京科美生物 | 进口仪器（BHP9504） 日本滨松公司 | 四项试剂全（丙肝无文号），全球第一个HIV微板试剂盒， |
郑州安图 | 进口仪器（Lucy2、Lucy3） 奥地利anthos公司 | HBsAg有文号，无产品？ |
厦门波生 | 进口仪器（VeritasTM） 美国Turner Biosystems | HBsAg |
重庆（杭州）埃夫朗 | 仪器（国内） | HBsAg |
洛阳 华美生物 | ？ | 无血检四项 |
国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
表4 SFDA注册的血检四项试剂
项目 | 国内公司 | 国外公司 |
HBsAg | 北京科美东雅，北京泰格科信，郑州绿科安图，重庆埃夫朗，厦门波生，北京源德 | Roche，Ortho， Sorin，Abbott |
TP | 北京科美东雅 | — |
HCV | 北京科美东雅 | Abbott，Ortho |
HIV | 北京科美东雅 | — |
三．化学发光法的优势及劣势。
上世纪70 年代末，Halmann 和Vela首先把化学发光(CL)与酶免疫反应结合起来，建立了化学发光酶免疫分
析法(CLIA)。目前，它已成为生命科学研究中的一个重要的分析手段，广泛应用于核酸分析、蛋白质分析、免疫分析、进行基因分析、发光成像分析、细胞分析等方面。其主要优势有：
1. 低检测限（高灵敏度）：就HBsAg检测，国内ELISA试剂检测限平均为0.5ng/ml，而胡国茂等试验显示化学发光检测限可达0.1ng/ml。Thoai Duong Ly.等对欧洲常使用的HbsAg检测试剂进行评测，检测线检测（HbsAg含量为0.04ng/ml—2.24ng/ml的系列血清）结果显示各试剂盒灵敏度均低于0.2ng/ml。值得注意的是，伯乐公司的Monalisa Ultra酶联免疫试剂盒达到了0.08ng/ml，甚至优于化学发光类仪器的检测。王丽梅等也证实Abbott的Murex HBsAg酶免试剂盒也可达到0.1ng/ml检测限。可以说，化学发光灵敏度只是优于目前的国内产品，单从技术角度，ELISA应和化学发光法等优。
1. 低检测限（高灵敏度）：就HBsAg检测，国内ELISA试剂检测限平均为0.5ng/ml，而胡国茂等试验显示化学发光检测限可达0.1ng/ml。Thoai Duong Ly.等对欧洲常使用的HbsAg检测试剂进行评测，检测线检测（HbsAg含量为0.04ng/ml—2.24ng/ml的系列血清）结果显示各试剂盒灵敏度均低于0.2ng/ml。值得注意的是，伯乐公司的Monalisa Ultra酶联免疫试剂盒达到了0.08ng/ml，甚至优于化学发光类仪器的检测。王丽梅等也证实Abbott的Murex HBsAg酶免试剂盒也可达到0.1ng/ml检测限。可以说，化学发光灵敏度只是优于目前的国内产品，单从技术角度，ELISA应和化学发光法等优。
表5 五种HBsAg检测试剂灵敏度评价
HBsAg 试剂盒 | Advia Centaur HBsAg | Liaison HBsAg | Vidas HBsAg Ultra | AxSym HBsAg V2 | Monolisa HBsAg Ultra |
公司 | Bayer | Dia-Sorin | bioMerieux | Abbott | Bio-Rad |
方法 | 吖啶酯 | 鲁米诺 | MEIA | MEIA | ELISA |
灵敏度 | 0.12 ng/ml | 0.11 ng/ml | 0.09 ng/ml | 0.16 ng/ml | 0.08 ng/m |
高的灵敏度检测能及早检出HBsAg，确证乙肝病毒感染，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间。另外，电化学发光法定量检测，克服了定性对灰区结果的判断困难，对灰区结果能做出明确客观的评价和判断。
2. 宽的线性范围：一般来说，ELISA的检测范围为2-3个数量级，而化学发光可以达到4～6个数量级，且为线性范围。这说明不仅能检测低浓度，对高浓度样本同样具有良好的检测能力，并减少了出现钩状效应的几率。
3. 分析速度快：由于采用自动化（半自动化）仪器，除去开机稳定、定标等时间，一般半小时内可以得到第一个标本结果，一小时可以出结果50-100个，这对于医院急诊病人非常重要。
表6 几种化学发光免疫分析仪性能比较
厂家 | Roche | Abbott | Beckman | Bayer | DPC |
仪器 | Elecsys 2010 | AxSYM | ACCESS | ACS:180 | Immulite |
原理 | 电化学 | MEIA | ALP/鲁米诺 | 吖啶酯标记 | ALP/dioxethane |
首结果时间 | 10 - 20 min | 8 - 30 min | 15 - 75 min | 15 min | 42 – 72 min |
结果/小时 | 57 - 72 | 60 - 100 | 0 - 75 | 100 - 130 | 0 - 45 |
标本量 | 10 - 50 μ | 30 - 200 μ | 6 - 100 μ | 10 - 200μ | 5 - 75 μ |
载机试剂稳定性 | 8 weeks | 112 hrs | 28 d | 1.7 d | 30 d |
试剂效期 | 6-12months | 6 - 12 months | 90 days | 365 d | 270 d |
4. 高稳定性： 由于全自动化操作，避免了人为的影响因素，结果的重复性很高。章火祥使用卫生部定值血清HBsAg项室内质控血清，对Roche的2010化学发光免疫分析仪和厦门新创的ELISA试剂盒进行比较，结果显示cv值：ELISA法批内3％ 一5％，批间5％ 一10％ ，而ECL法批内小于3％，批间小于5％。马蔡昀对Roche的2010化学发光免疫分析仪和科华的ELISA试剂盒进行比较，结果亦显示电化学法比ELISA法的批内、批间cv值均小。
5. 操作便捷：全自动化仪器，多数仅需加入一种试剂。
虽然化学发光法是标记免疫技术的一项重要发展，也逐渐占据了主流市场，但并不是说没有其局限性。尤其是针对不同的检测项目，不同的地域差异，化学发光法并不能一统天下。ELISA法、金标法、甚至放免法仍有广阔的用武之地。
1. 不适于检测大量标本：自动化仪器虽然适宜于急性结果的报告，但对于大量样本的检测，显然ELISA发更具有优势。目前大型医院的门诊和住院标本采用仪器检测，而体检标本（200-400人/次）均采用ELISA法检测，这当然和检测费用以及结果的不急需有关。
2. 检测费用高：根据北京市医疗服务收费标准。从下表可以看出，化学发光法的收费基本上是普通ELISA的
5-7倍。这样的价格主要是由于昂贵的仪器以及后继的试剂消耗。国外厂家的封闭试剂造成了一定的垄断，也导致了价格的虚高。
表7 北京市一些免疫检测项目收费情况
国产ELISA | 进口ELISA | 化学发光法/MEIA | |
HBsAg | 7元/人 | 20元/人 | 35元/人 |
Anti-HBslisa多高 | 7元/人 | 25元/人 | 40元/人 |
HBeAg | 7元/人 | 40元/人 | 50元/人 |
Anti-HBe | 7元/人 | 40元/人 | 50元/人 |
Anti-HBc | 7元/人 | 55元/人 | — |
HCV | 20元/人 | 60元/人 | 90元/人 |
3. 仪器维护需要专业人员：检验科医生经培训应能对仪器进行操作和简单维护，但由于仪器故障造成的试剂、标本浪费、报告延迟也会发生。这一点上，简便快捷的ELISA、金标法应具有很大优势。
四．化学发光在血筛中的应用前景。
根据《采供血机构质量管理规范》，我国的国内血液筛查项目及检测方法如下表。《规范》规定所有初筛（批批检四项检测）反应性标本必须使用与最初检测相同的试剂和方法进行双次复检。两次复检结果均为无反应性，该血液和所制备的血液成分可以放行。
表8 我国血站血液筛查检测项目
实验项目 | 实验方法 | 试剂要求 |
ABO血型正反定型 | 玻片法/试管法/微板法 | 略。。 |
Rh血型D抗原 | 玻片法/试管法/微板法 | 略。。 |
乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） | ELISA | 试剂生产商应具有国家批准的相关资质，试剂应经过国家有关部门的批批检定。 |
抗丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV） | ELISA | |
抗艾滋病病毒抗体（抗-HIV1和2） | ELISA | |
抗梅毒螺旋体抗体（抗-TP） | ELISA | |
梅毒血清反应素 | TRUST/RPR | |
丙氨酸氨基移换酶（ALT） | 赖氏法/酶动力学法 | 试剂生产商应具有国家批准的相关资质 |
ELISA法仍是主要的筛查方法，ELISA方法简便、快速、可大量检测，且随着技术的不断改进，灵敏度/特异性也逐步提高。但也存在着一些问题，如(1)低滴度血清敏感性问题，如“窗口期”低滴度HBsAg的检测；(2)突变株的检测，如现有的HBsAg检测试剂均采用单克隆抗体，新的突变株不断出现，如何检测这些突变株。(3)ELlSA检测试剂H00K效应和非特异性反应问题。
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