孙
涛
1
刘圣红
1
乔昆云
1
廖春蓉
2
(1.新疆农业科学院中心实验室，乌鲁木齐，830091;2.乌鲁木齐高新区疾病预防控制中心，乌鲁木齐，
830011)摘要
采用超高效液相谱－串联质谱(UPLC －MS /MS )技术，检测了猪尿中9种β－受体激动剂的残留。样
品加入乙酸铵溶液后经β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，用氢氧化钠溶液调pH ，分别用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚萃取、浓缩后过MCX 柱净化，以甲醇0．1%甲酸溶液(10+90)定容，经Waters C 18超高压液相谱柱分离，电喷雾(ESI )串联四极杆质谱检测，采用多反应监测(MRM )分析，对液质分离条件和样品前处理条件进行了优化。结果表明，9种β－受体激动剂在1．0 100ng /mL 范围内线性良好相关系数r 均大于0．9990，定量限范围为0．037 0．14μg /L 。该方法简便、快速、灵敏，测定结果能满足猪尿中β－受体激动剂的多残留检测要求。
关键词
超高效液相谱－串联质谱
猪尿
β－受体激动剂
多残留
作者简介：孙涛，男，1978年出生，实验师，主要从事农产品质量安全监测分析工作。E-
mail :suntaotxy@126．com β－受体激动剂(β－agonists )是一类化学合成的
苯乙醇胺类衍生物，可分为含取代基的苯胺型(如克仑特罗)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大类。欧盟、美国等都先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国政府也早在2002年
就明令禁止使用［1］
。
β－受体激动剂残留检测手段主要有酶联免疫
法(ELISA )［2］、气质联用法(GC －MS )［3，4］
、液相谱
串联质谱法(HPLC －MS /MS )
［5，6］
等，确证方法为GC －MS 法和HPLC －MS /MS 法。其中ELISA 法是初步筛查方法，且专一性强，无法进行多残留同时检测。
GC －MS 法样品处理需要衍生化，过程较为繁琐。HPLC －MS /MS 法是对β－受体激动剂残留定量定性分析的较好手段。本实验应用超高效液相谱－串联质谱法(UPLC －MS /MS )结合电喷雾离子源(ESI +)和超高压液相谱柱Acquity BEH C 18(2．1mm ˑ50mm ，1．7μm )，同时分析猪尿中9种β－受体激动剂残留，实验完成一次分析需12min ，缩短了样品分析时间，减少了流动相使用量。UPLC －MS /MS 是进行β－受体激动剂残留分析较为理想的仪器。结果表明本方法上机分析时间短，高效快速，灵敏度高；适用于日常抽查猪尿样品的β－受体激动剂残留检测。
1
实验部分
1.1
仪器与试剂
Acquity UPLC 超高效液相谱仪，Waters 公司;Micromass Quattro Premier XE 三重四级杆串联质谱仪配有电喷雾离子源(ESI )，
Waters 公司；旋转浓缩仪，
EYELA 公司;Milli －Q 超纯水设备，Millipore 公司；漩涡混合器，IKA 公司;SHA －C 恒温水浴振荡器，华峰仪器公司;CT －15RT 低温高速离心机，天美公司;Oasis MCX 小柱，
3mL /60mg ，Waters 公司；微孔滤膜为0．2μm ，
Pall 公司;β－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，
Merk 公司。乙酸铵、甲酸、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等均为谱纯；其他试剂均为分析纯。水为超纯水。
标准品储备液均用甲醇配制，4ħ避光保存(有效期3个月)；工作液用水由储备液稀释，现用现配。1.2
谱条件
谱柱:Acquity BEH C 18(2．1mm ˑ50mm ，
1．7μm )；流速:0．20mL /min ；柱温:40ħ；样品室温度:
10ħ；进样量:10μL ；流动相：溶剂A 为0．1%甲酸乙腈溶液，溶剂B 为0．1%甲酸水溶液。梯度洗
脱:0min 2min ，维持4%A ;2min 10min ，4%A 线性变化至60%A ;10min 10．1min ，
60%A 线性变化至4%A ;10．1min 12min ，维持4%A 。1.3
质谱条件
离子源：电喷雾离子源(ESI )；毛细管电压:3．00kV ；离子源温度:110ħ；锥孔反吹气流量:50L /h ；脱溶剂气温度:350ħ；脱溶剂气流量:650L /h ；碰撞气：氩气，流量:0．24mL /min ，驻留时间50ms ；多
6
3分析仪器
2012年第3期
反应监测扫描模式(MRM)，其它质谱参数见表1:
表1多反应监测扫描模式(MRM)的部分质谱参数
化合物定性离子对
m/z
定量离子对
m/z
锥孔电压
CP(V)
碰撞气能量
CE(eV)
保留时间
RT(min)
特布他林226．0＞151．6226．0＞151．625201．83 226．0＞124．525
西马特罗220．0＞201．9220．0＞201．918101．90 220．0＞159．618
沙丁胺醇240．1＞147．5240．1＞147．519181．96 240．1＞221．910
非诺特罗304．2＞106．5304．2＞106．528353．86 304．2＞134．620
氯丙那林213．8＞153．5213．8＞153．522125．16 213．8＞195．811
莱克多巴胺302．2＞163．6302．2＞163．620205．19 302．2＞106．532
克仑特罗277．0＞202．7277．0＞202．725175．72 277．0＞258．812
妥布特罗227．9＞153．6227．9＞153．623175．74 227．9＞171．612
喷布特罗292．1＞235．9292．1＞235．930189．04 292．1＞200．823
1.4标准曲线绘制
分别精密量取适量9种β－受体激动剂标准工作液，得浓度为1、5、10、20、100ng/mL的系列对照溶液，以各特征离子质量谱峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.5样品前处理
准确移取5mL尿样于50mL离心管中，加入8mL0．2M乙酸铵溶液(pH=5．2)和40μL－盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，漩涡混匀后，置于恒温水浴振荡器中37ħ避光振荡16h。取出离心管冷却至室温，用10M NaOH溶液调pH至9．5ʃ0．2，加入乙酸乙酯15mL，剧烈振摇2min，10000r/min 离心3min，有机相移入浓缩瓶，继续加入甲基叔丁基醚10mL，剧烈振摇2min，10000r/min离心3 min，合并有机相，40ħ水浴缓慢浓缩蒸发至干，用2%甲酸溶液5mL溶解，备用。MCX柱依次用3mL 甲醇、水、2%甲酸溶液活化，取备用液全部过柱，再依次用3mL2%甲酸溶液、甲醇淋洗，抽干，用3%氨水甲醇2．5mL洗脱；洗脱液40ħ水浴浓缩至干，准确加入0．5mL甲醇－0．1%甲酸溶液(10+90)，漩涡后过0．2μm滤膜上机测定。
2结果与讨论
2.1UPLC-MS/MS分离条件的选择
本实验采用Waters公司的超高压液相谱柱Acquity BEH C18(2．1mmˑ50mm，1．7μm)对样品进行了分离，采用了不同的梯度洗脱程序，在10min 内完成对9种β-受体激动剂的有效分离，取得满意结果；同时对各项质谱条件进行了设定(见表1)，使各被测物的响应值达到最佳。图1为9种β-受体激动剂总离子流谱图。
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2012年第3期分析仪器
图19种β-受体激动剂总离子流谱图
图中横坐标为时间(min)，纵坐标为
相对丰度(%)。
2.2标准曲线、检出限
2.2.1标准曲线
按照上述方法得出回归方程和相关系数，结果见表2。可以看出9种β－受体激动剂回归方程及相关系数在1 100ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0．9990。
2.2.2检测限
按S/N=3计算，9种β－受体激动剂检测限(ng/mL)分别为特布他林0．14、西马特罗0．087、沙丁胺醇0．13、非诺特罗0．14、氯丙那林0．094、莱克多巴胺0．067、克仑特罗0．068、妥布特罗0．079、喷布特罗0．037。
2.3方法的回收率和精密度
表29种β-受体激动剂回归方程及相关系数
药物线性方程r
特布他林A=1430．7ρ+1034．10．9999
西马特罗A=1471．4ρ+832．00．9990
沙丁胺醇A=2298．1ρ+710．80．9998
非诺特罗A=582．7ρ+216．00．9997
氯丙那林A=2188．0ρ+1781．10．9999
莱克多巴胺A=484．6ρ+386．80．9999
克仑特罗A=710．8ρ+329．30．9997
妥布特罗A=2860．0ρ+1645．20．9998
喷布特罗A=1856．2ρ+1008．80．9999
表3猪尿中添加9种兴奋剂类药物精确度测定结果
(n=3)(ρ/(ng·mL－1，%)药物标准加入量回收量回收率RSD
特布他林21．8894．03．6
西马特罗21．8994．54．1
沙丁胺醇21．9497．04．7
非诺特罗21．9597．51．8
氯丙那林21．9497．02．5
莱克多巴胺21．9296．03．1
克仑特罗21．8291．02．2
妥布特罗21．8693．02．9
喷布特罗21．9396．53．0
在空白猪尿中添加2ng/mL9种药物进行回收率试验，结果汇总见表3，从中可以看出9种药物平均回收率范围为91．0% 97．5%，RSD范围为1．8% 4．7%。
参考文献
［1］农业部公告第193号(食品动物禁用的兽药及其它化合物清单)2002．
［2］李艳，张明洲，陈宗伦，等．猪尿中克伦特罗残留的ELISA检测研究，浙江农业学报，2006，18(5):328
－332．
［3］刘维华，谢荣国，陈娟，等．猪尿中"瘦肉精"GC/MS 法定量检测及应用，中国饲料添加剂，2007，(5):37
－40．
［4］农业部1031号公告－3－2008猪肝和猪尿中β－受体激动剂残留检测气相谱－质谱法．
83分析仪器2012年第3期
［5］孙雷，刘琪，张骊，等．高效液相谱－串联质谱法检
测猪尿中四种β－受体激动剂残留的研究，中国兽药杂志，
2008，42(4):15－18．［6］农业部1025号公告－11－2008猪尿中β－受体激动剂
孙涛多残留检测液相谱－串联质谱法．
收稿日期:2011－07－21
Determination of nine β-agonists residues in pig urine by UPLC-MS /MS．Sun Tao ，Liu Shenghong ，Qiao Kunyun ，Liao Chunrong (1.Analytical Center of XinJiang Academy of Agricultural Science ，Urumqi ，830091;2.Centre for Disease Control of High-tech Development Zone ，Urumqi ，830011)
Abstract :An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method (UPLC-MS /MS )was applied to the simultaneous determination of nine β-agonists in pig urine．The analytes added ammonium ace-tate solution ，β-glucosidase /aryl sulfatase ，then adjusted pH with NaOH solution．Extraction with ethyl acetate and tert-butyl methyl ether ，the analytes were dissolve with methanol solution (CH 3OH :0．1%HCOOH solution =10:90)．The UPLC-MS /MS analyses were performed on an Acquity UPLC C18column with gradient eluation ，com-bined with electrospray ionization in positive mode (ESI +)and multiple reaction monitoring (MRM )mode．The linear range was fro
m 1．0ng /mL to 100ng /mL ，the correlation coefficients were between 0．9990and 0．9999．The range of the limit of detection (LOD )for the β-agonists was from 0．037ng /mL to 0．14ng /mL．The results indicated that this method is easy ，rapid and more sensitive．It also demonstrated that the method can meet the re-quirements for identification and quantification of the β-agonists in pig urine．
Keywords :UPLC-MS /MS ;pig urine ;β-agonists ;multi-residues
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32012年第3期
分析仪器
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