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摘要 (I)
Abstract (Ⅱ)
第1章绪论 (1)
1.1紫花苜蓿研究进展 (1)
1.1.1紫花苜蓿次生代谢产物研究进展 (1)
1.1.2紫花苜蓿金属转运研究进展 (1)
1.1.3紫花苜蓿植物激素研究进展 (2)
1.2MATE基因的研究进展 (2)
1.2.1MATE转运次生代谢产物 (3)
1.2.2MATE转运金属离子 (3)
1.2.3MATE参与植物激素信号传递 (5)
1.3本课题的研究目的和意义 (5)
1.4技术路线 (6)
第2章紫花苜蓿(Medicago sativa)MsMATE1基因的克隆及分析 (7)
2.1引言 (7)
2.2实验材料 (7)
2.2.1植物材料 (7)
2.2.2载体和菌株 (7)
2.2.3主要仪器设备 (7)
2.2.4主要试剂 (8)
2.3实验方法 (10)
2.3.1植物总RNA提取 (10)
2.3.2PCR扩增目的基因 (12)
2.3.3MsMATE1基因克隆载体的构建 (13)
2.3.4MsMATE1基因的生物信息学分析 (14)
2.3.5qRT-PCR (14)
2.3.6铁胁迫处理紫花苜蓿 (16)
2.4实验结果 (16)
2.4.1MsMATE1基因的克隆 (16)
2.4.2pMD18T-MsMATE1克隆载体的构建 (16)
2.4.3MsMATE1基因的生物信息学分析 (17)
2.4.4MsMATE1的组织表达量分析 (21)
2.4.5铁胁迫下紫花苜蓿MsMATE1的表达量分析 (22)
2.5本章讨论 (22)
2.6本章小结 (23)
哈尔滨师范大学硕士学位论文
第3章MsMATE1基因启动子克隆 (24)
3.1引言 (24)
3.2实验材料与药品 (24)
3.2.1实验材料 (24)
3.2.2实验药品 (24)
3.3实验方法 (26)
3.3.1紫花苜蓿基因组DNA的提取 (26)
3.3.2PCR扩增目的条带 (27)
3.3.3基因片段的胶回收 (27)
3.3.4pMD18T-MsMATE1启动子克隆载体的构建 (27)
3.3.5紫花苜蓿MsMATE1基因启动子生物信息学分析 (28)
3.3.6pBI121MsMATE1pro::GUS植物表达载体的构建 (28)
3.4结果与分析 (30)
3.4.1MsMATE1启动子的克隆 (30)
3.4.2MsMATE1基因启动子顺式作用元件分析 (31)
3.4.3pBI121MsMATE1pro::GUS植物表达载体的构建 (33)
3.5本章讨论 (33)
3.6本章小结 (35)
第4章MsMATE1基因对烟草的遗传转化 (36)
4.1引言 (36)
4.2实验材料 (36)
4.2.1植物材料 (36)
4.2.2质粒载体与菌株 (36)
4.2.3实验药品及仪器 (36)
4.3实验方法 (36)
4.3.1植物表达载体的构建 (36)
4.3.2农杆菌转化 (39)
4.3.3烟草的遗传转化 (39)
4.3.4转MsMATE1烟草的分子鉴定 (40)
4.4实验结果 (41)
4.4.1pBI121-MsMATE1植物表达载体的构建 (41)
4.4.2pBI121-MsMATE1转化农杆菌 (42)
4.4.3MsMATE1转化烟草 (42)
4.4.4转MsMATE1烟草的PCR检测结果 (42)
4.5本章讨论 (43)
4.6本章小结 (44)
第5章转MsMATE1基因烟草的生理检测分析 (45)
5.1引言 (45)
5.2实验材料及药品 (45)
5.2.1植物材料 (45)
5.2.2实验药品 (45)
5.3实验方法 (46)
5.3.1铁胁迫转MsMATE1基因烟草 (46)
欧美无mate30pro巨5.3.2生理指标检测 (46)
5.3.3数据分析 (50)
5.4实验结果与分析 (51)
5.4.1叶绿素含量 (51)
5.4.2抗氧化酶活性 (51)
5.4.3丙二醛（MDA）含量 (52)
5.4.4可溶性蛋白含量 (53)
5.5本章讨论 (54)
5.6本章小结 (55)
结论 (56)
参考文献 (57)
攻读硕士学位期间发表的学术论文 (64)
哈尔滨师范大学学位论文原创性声明 (65)
致谢 (66)
摘要
多药和有毒化合物外排（MATE）蛋白转运次生代谢产物、激素和金属离子，参与植物体内多种生理活动。紫花苜蓿是具有较强的抗逆性的重要牧草作物。本研究克隆紫花苜蓿MsMATE1基因及其启动子。构建了植物表达载体pBI121-MsMATE1和pBI121MsMATE1pro::GUS，将pBI121-MsMATE1转入烟草中，对MsMATE1进行了初步的功能鉴定。取得的主要研究结果如下：
1.MsMATE1基因的克隆与生物信息学分析
RT-PCR方法克隆获得MsMATE1基因。MsMATE1长1470bp，编码489个氨基酸，具有MatE结构域。MsMATE1蛋白属于疏水性蛋白，二级结构中α螺旋（Alpha helix）和无规卷曲（Random coil）含量最多，有12个跨膜结构域。系统发育分析表明，紫花苜蓿MsMATE1与蒺藜苜蓿MtMATE关系最为密切。
2.MsMATE1基因的表达特性
利用qRT-PCR对MsMATE1在紫花苜蓿不同部位的相对表达量进行检测，结果表明MsMATE1的表达量为茎>根>叶，茎中MsMATE1的表达量显著高于根和叶（P<0.01）。高铁和缺铁胁迫下根、茎、叶中MsMATE1的表达量均上调，高铁胁迫下根中MsMATE1的表达量显著增高。实验结果表明MsMATE1响应铁胁迫。
3.MsMATE1启动子克隆及植物表达载体构建
获得MsMATE1启动子，长1598bp，包含多个与非生物胁迫和激素相关的顺式作用元件。构建了pBI121MsMATE1pro::GUS植物表达载体。
4.MsMATE1基因的载体构建及遗传转化
构建了pBI121-MsMATE1植物表达载体，并转入到GV3101，叶盘法转化烟草，卡那霉素（Km）筛选获得14株抗性植株，PCR鉴定出4株转基因阳性苗（T4、T6、T7、T13）。
5.铁胁迫下转MsMATE1基因烟草的生理指标
缺铁或高铁胁迫下转基因烟草叶绿素的含量均显著高于WT。抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性和可溶性蛋白含量均显著高于WT，丙二醛含量显著低于WT。表明MsMATE1基因赋予了烟草对缺铁和高铁胁迫的耐受性。
关键词MsMATE1；紫花苜蓿；启动子；遗传转化；铁胁迫
哈尔滨师范大学硕士学位论文
Abstract
Multidrug and Toxic Compound Effluents(MATE)protein transport secondary metabolites,hormones and metal ions,and participate in a variety of physiological activities in plants.Alfalfa is an important forage crop with strong resistance to stress. MsMATE1gene and its promoter in alfalfa were cloned in this study.Plant expression vectors pBI121-MsMATE1and pBI121MsMATE1pro::GUS were constructed,pBI121-MsMATE1was transferred into tobacco.The function of MsMATE1was preliminarily identified.The main research results are as follows:
1.Cloning and bioinformatics analysis of MsMATE1
The MsMATE1gene was cloned by RT-PCR.MsMATE1is1470bp,codes for489 amino acids,and has the MatE domain.M
sMATE1protein is a hydrophobic protein, with the highest contents of Alpha helix and Random coil in the secondary structure and contains12transmembrane domains.Phylogenetic analysis showed that the relationship between MsMATE1and MtMATE was the closest.
2.Expression characteristics of MsMATE1gene
The relative expression of MsMATE1in different tissues of alfalfa was detected by qRT-PCR.The results showed that the expression order of MsMATE1was shoot> root>leaf,and the expression of MsMATE1in shoot was significantly higher than that in root or leaf(P<0.01).The expression of MsMATE1was up-regulated in roots,stems and leaves under iron excess or iron deficiency stress,and the expression of MsMATE1 was significantly increased in roots of alfalfa under iron excess.The experimental results showed that MsMATE1responded to iron stress.
3.MsMATE1promoter cloning and construction of plant expression vector
The MsMATE1promoter with1598bp,contains multiple cis-acting elements related to abiotic stress and hormones was obtained.pBI121MsMATE1pro::GUS plant expression vector was constructed.
4.Vector construction and genetic transformation of MsMATE1gene
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