纤维含量分析
李博，张丹丹，程景，靳光，王栋才，孙锐锋，徐芳，梁圆，张元庆*
（山西农业大学（山西省农业科学院）动物科学学院，山西太原 030032）
摘 要：本试验采用传统滤袋代替ANKOM滤袋测定饲料中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量，并以滤袋法验证结果，旨在校正ANKOM纤维仪测定结果，探索一种简单方便、节约成本的饲料NDF、ADF测定方法。试验采用滤袋法、ANKOM纤维仪法、ANKOM纤维仪（传统滤袋）测定13种饲料（小麦秸、构树、连翘、苜蓿、苜蓿青贮、全株玉米青贮、豆科青贮、精料、白酒糟、豆粕、玉米胚芽饼、DDGS、喷浆玉米）中的NDF、ADF含量。结果表明：经过配对样本T检验分析，ANKOM纤维仪法、ANKOM纤维仪（传统滤袋）与滤袋法相比较，以及ANKOM纤维仪（传统滤袋）与ANKOM纤维仪法比较，NDF、ADF测定结果差异均不显著；以滤袋法校正的ANKOM纤维仪法和ANKOM纤维仪（传统滤袋）测定饲料中的NDF、ADF含量建立的回归公式分别为NDF
滤袋法
=-1.46+1.064NDF ANKOM（R2=0.923，P<0.001），
NDF
滤袋法
=0.786+0.993NDF ANKOM（传统滤袋）（R2=0.884，P<0.001）；ADF滤袋法=0.545+1.026ADF ANKOM（R2=0.954，
P<0.001），ADF
滤袋法
=1.176+0.996ADF ANKOM（传统滤袋）（R2=0.936，P<0.001）。可见，使用传统滤袋代替ANKOM滤袋测定饲料NDF、ADF含量是可行的。
关键词：ANKOM纤维仪法；饲料；中性洗涤纤维；酸性洗涤纤维
中图分类号：S816 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200413-01
传统测定饲料中粗纤维（CF）的方法是经过稀酸、稀碱处理后烘干可得，此方法测定的结果仅包括部分纤维素、半纤维素和木质素，测得的结果会低于实际测定结果[1]。Van Soest等[2]在1991年提出测定饲料中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的方法，主要是通过消煮、过滤法进行参比分析，目前仍是学界公认的精准度较高的方法。在此原理
基础上，发展了滤袋法、ANKOM纤维仪法[3-4]。朱立涛等[5]、张崇玉等[6]用滤袋法测定了饲料原料的CF含量，同时以国标法测定结果验证了滤袋法测定结果的准确性，表明滤袋法测定粗纤维是可行的。刘磊等[7]采用滤袋法测定了饲料CF、NDF和ADF残渣中各成分含量。国内研究已对滤袋法和ANKOM测定方法进行改进[8-9]。但ANKOM 原装滤袋价格昂贵，为了节约成本，同时探索一种测定NDF、ADF准确高效的方法，本试验将传统滤袋用于ANKOM仪器中测定饲料中NDF、ADF，并采用滤袋法和ANKOM纤维仪法验证其测定准确性及可行性，为饲料中NDF、ADF的不同测定方法分析以及饲料数据库建立时的差异分析提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料试验选取13个高纤维、低纤维饲料（小麦秸、构树、连翘、苜蓿、苜蓿青贮、全株玉米青贮、豆科青贮、精料、白酒糟、豆粕、玉米胚芽饼、DDGS、喷浆玉米），65℃烘干制成风干样品，粉碎，过40目筛，然后将样品充分混合均匀，密封保存以备分析测定。
饲料纤维分析滤袋（传统滤袋）由北京一牛肉牛信息技术研究中心研制，进口特制无纺布，42 mm×53 mm，孔径38~45 μm。ANKOM专用滤袋F57（ANKOM
收稿日期：2020-04-13；修回日期：2020-06-04
资助项目：农牧交错带牛羊牧繁农育关键技术集成示范项目（16200158）；山西省农科院农业科技创新研究课题优势课题组（YCX2018D2YS03）；山西省现代农业产业技术体系（2017-05）
作者简介：李博（1983-），男，山西运城人，助理研究员，研究方向为反刍动物营养与调控，E-mail：***************** *通讯作者：张元庆，研究员，硕士研究生导师，E-mail：**********************
2000i型全自动纤维分析仪，孔径25 μm，美国ANKOM科技公司）。
1.2 滤袋法测定NDF、ADF含量
1.2.1 滤袋法测定饲料NDF含量①将滤袋用2B铅笔编号后置于105℃烘箱中烘干，称重。②样品烘干称重，计算水分或干物质含量。③称取风干饲料样品0.5~0.6 g，无损转移至滤袋中，并用塑料袋封口机封口。每个样品做4个平行样。④在600 mL高腰烧杯中加入约260 mL 中性洗涤剂、2~3滴十氢化萘、耐高温α-淀粉酶6 mL 和0.5 g无水亚硫酸钠，再放入3~4个已装好样品的滤袋，并放置压块。⑤套上冷凝装置，在调温电炉上加热，煮沸1 h。⑥煮沸完毕后取出滤袋，并用热水冲洗和洗衣机甩干5次以上，直至洗液中无泡沫，再用20 mL 丙酮冲洗2次。⑦将滤袋置于105℃烘箱中烘干，称重。
1.2.2 滤袋法测定饲料ADF含量①同1.2.1测定步骤
①、②和③。②在600 mL高腰烧杯中加入约260 mL 酸性洗涤剂、2~3滴十氢化萘，再放入3~4个已装好样品的滤袋，并放置压块。③同1.2.1测定步骤⑤。④煮沸完毕后取出滤袋，用热水冲洗和甩干滤袋至洗液呈中性，再用少量的丙酮冲洗2次。⑤同1.2.1测定步骤⑦。
1.3 ANKOM测定饲料NDF、ADF含量使用ANKOM 专用滤袋F57，操作步骤遵循ANKOM 2000i的操作说明。每个饲料样
品做4个平行，样品称样0.5~0.6 g。
1.4 ANKOM（传统滤袋）测定饲料NDF、ADF含量使用传统滤袋，具体操作步骤遵循ANKOM 2000i的操作说明。每个饲料样品做4个平行，样品称样0.5~0.6 g。
1.5 统计分析试验数据用Excel 2016整理，以平均值±标准差的方式表示。使用SPSS 21.0对变量结果进行配对样本T检验及线性回归分析，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 不同方法测定饲料中NDF含量的分析由表1可知，经过配对样本T检验分析，ANKOM纤维仪法、ANKOM纤维仪（传统滤袋）与滤袋法以及ANKOM 纤维仪（传统滤袋）与ANKOM纤维仪法配对分析测定结果差异均不显著。
2.2 不同方法测定饲料中ADF含量的分析由表2可知，ANKOM纤维仪法、ANKOM纤维仪（传统滤袋）与滤袋法经过配对以及ANKOM纤维仪（传统滤袋）与ANKOM纤维仪法配对分析测定结果差异均不显著。
2.3 ANKOM测定饲料中的NDF、ADF含量校正结果以滤袋法测定饲料中的NDF、ADF结果校正ANKOM 纤维仪法和ANKOM纤维仪（传统滤袋）测定结果，建立的回归公式极显著（P<0.001），ANKOM纤维仪法和ANKOM纤维仪（传统滤袋）测定结果与滤袋法测定结果有密切的相关性，建立的公式有意义（表3）。
3 讨论
Van Soest等[2]提出的测定NDF、ADF方法，虽说仍是国际上公认的测定NDF、ADF准确度较高的方法，但在实际测定过程中发现煮沸时间、消煮方式、饲料质量、洗涤液比例、过滤时滤孔的孔径大小以及滤膜面积等均会对饲料NDF、ADF的测定结果产生影响[10-12]。另外在测定过程中，每次消煮只能测定一个样品，测定量表1 不同方法测定饲料中的NDF含量的分析（风干基础） % 样品滤袋法
ANKOM纤
维仪法
ANKOM（传
统滤袋）
小麦秸65.10±1.9765.96±0.6566.97±0.01
构树31.97±0.8639.05±1.8243.34±0.35
连翘41.08±0.0440.06±0.2738.53±0.7
苜蓿42.95±0.9940.45±0.3342.13±0.02
苜蓿青贮37.55±0.9537.41±0.4437.84±2.04
全株玉米青贮50.18±2.5646.02±4.5644.21±4.36
豆科青贮50.10±0.6945.56±1.3747.04±2.74
精饲料13.49±0.4113.05±0.3912.57±0.84
白酒糟51.12±0.0645.02±0.6844.92±1.65
豆粕20.57±1.3726.04±5.7023.08±0.77
玉米胚芽饼39.31±0.7937.34±0.1541.36±1.10 DDGS35.58±0.7833.12±1.2834.42±0.16
喷浆玉米40.64±1.8837.02±0.7136.73±1.33 ANKOM纤维仪法-滤袋法配对分析
配对分析平均值 1.04
SEM 1.05
P值 0.341
ANKOM（传统滤袋）-滤袋法配对分析
配对分析平均值0.50
SEM 1.26
P值 0.700
ANKOM（传统滤袋）-ANKOM纤维仪法配对分析
配对分析平均值-0.54
SEM 0.58
P值 0.371
少；消煮过程中，温度及冷凝水调节不当时会造成洗涤剂沸腾，且在抽滤过程中容易造成样品损失。
滤袋法是在Van Soest 法的基础上，改进得到的一种精确、简便的方法。使用滤袋法测定时可将多个滤袋放于同个烧杯中一起消煮，可以扩大样品测定量；在洗涤过程中省去抽滤步骤，避免抽滤耗时耗力，而滤袋也因其独特的材质可避免洗涤时造成的包装破裂样品损失。所以滤袋法测定同时可以批量测定多个样品，既提高了试验测定的准确度、精确度；也
提高了试验的效率，节省时间[4]。杨喆等[13]利用滤袋法测定苜蓿草中粗纤
维的含量，操作方法简单，检测效率高，且适用于大批量测定；张晨等[14]研究表明聚酯网袋法与国标法测定饲料的CF 以及滤袋法与国标法测定饲草中NDF 、ADF 含量结果[15]均差异不显著，且用滤袋法效率高、成本低，精密度优于国标法。
ANKOM 纤维仪法相较于滤袋法，可以解决因加热不均造成的洗涤剂浓度变化引起的测定误差，减少了因人为操作造成的测定误差，且试验操作过程简单、安全，测定样品量更大。Nguyen 等
[16]
分别按照AOAC
991.43和AOAC 2011.43方法用ANKOM 仪器测定日粮总纤维以及可溶性和不溶性纤维的含量无差异，表明ANKOM 仪器测定纤维含量准确率较高。但ANKOM 纤维仪价格昂贵，原装滤袋价格较高。
利用滤袋法和ANKOM 纤维仪法测定饲料NDF 、ADF 时，称取的样品质量均为0.5~0.6 g ，相较于Van Soest 法，滤袋法和ANKOM 法省去了抽滤的过程，消除了因为抽滤产生的误差。滤袋材质及孔径的大小同样会影响纤维的测定结果
[17]
，一般纤维测定仪会配有专
用的纤维滤袋，ANKOM 纤维滤袋价格昂贵，来源单一，测定样本量大时费用较高。因此，本研究设计了利用传统滤袋代替ANKOM 滤袋测定饲料NDF 、ADF 含量试验，各操作步骤与ANKOM 纤维仪法均保持一致，所用饲料来自同一批，消除因饲料原料、操作等不同造成的测定误差。通过与滤袋法配对样本T 检验分析试验结果，NDF 、ADF 测定结果差异均不显著，表明用传统滤袋代替ANKOM 原装滤袋测定饲料中的NDF 、ADF 含量是可行的。在此基础上，本研究建立了滤袋法校正ANKOM 法（传统滤袋）测定测定饲料中的NDF 、ADF 含量回归公式，说明ANKOM 纤维仪法和ANKOM 纤维仪（传统滤袋）测定结果与滤袋法测定结果有密切的相关性，建立的公式有意义。
4 结 论
本研究通过配对样本T 检验分析，使用传统滤袋代替ANKOM 滤袋测定饲料NDF 、ADF 含量差异不显著，可以用传统滤袋代替ANKOM 原装滤袋测定饲料中的NDF 、ADF 含量。不同方法测定测定饲料中的NDF 、ADF 含量建立的校正公式分别为NDF 滤袋法=-1.46+1.064NDF ANKOM （R 2=0.923，P <0.001），NDF 滤袋法=0.786+0.993NDF ANKOM （传统滤袋）（R 2=0.884，P <0.001）；ADF 滤袋法=
表3 不同方法测定饲料中NDF 、ADF 含量校正结果
表2 不同方法测定饲料中的ADF 含量的分析（风干基础）
%样品滤袋法ANKOM 纤
维仪法ANKOM （传统滤袋）小麦秸 36.94±1.2036.56±0.1437.76±0.15构树21.33±0.2120.81±0.3520.79±0.02连翘28.36±0.1924.56±0.6724.89±0.02苜蓿29.50±2.7128.05±0.4228.80±0.49苜蓿青贮27.04±0.2127.99±0.5827.88±0.06全株玉米青贮31.15±1.0625.73±1.0223.95±2.11豆科青贮31.71±1.0634.12±0.1534.31±0.82精饲料 5.04±0.11 4.41±0.05 3.69±0.04白酒糟 34.26±0.0429.29±0.0229.21±1.44豆粕 13.26±1.2014.29±2.0513.22±0.35玉米胚芽饼 11.14±0.4111.17±0.4612.55±0.12DDGS 10.63±0.1010.04±0.1210.70±0.22喷浆玉米
11.57±0.37
10.56±0.36
10.04±0.55
ANKOM 纤维仪法-滤袋法配对分析配对分析平均值 1.10SEM
0.64P 值
0.112
ANKOM （传统滤袋）-滤袋法配对分析配对分析平均值 1.09SEM
0.76P 值
0.176
ANKOM （传统滤袋）-ANKOM 纤维仪法配对分析配对分析平均值-0.02SEM
0.25P 值
0.949
回归公式
决定系数（R 2）
P 值NDF 滤袋法=-1.46+1.064NDF ANKOM
0.923<0.001NDF 滤袋法=0.786+0.993NDF ANKOM （传统滤袋）0.884<0.001ADF 滤袋法=0.545+1.026ADF ANKOM
0.954<0.001ADF 滤袋法=1.176+0.996ADF ANKOM （传统滤袋）
0.936
李博
<0.001
0.545+1.026ADF ANKOM（R2=0.954，P<0.001），ADF滤袋法=
1.176+0.996ADF ANKOM（传统滤袋）（R2=0.936，P<0.001）。参考文献：
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（责任编辑：郑本艳）
Abstract: The purpose of this study was to clone the peroxidosome proliferator-activated receptor α and γ, analyze their bioinformatics characteristics and explore their expression patterns in different tissues of landrace. Primers were designed according to the sequence of pig PPARα (access number NM_001044526) and PPARγ (access number NM_214378.1) in GenBank database. With aged 6-months landrace as test subjects, the gene sequence was amplified by PCR technology and connected with pcdna-3.1 vector, then it was transferred to DH5α competent cell, and selected the single colony. The mRNA expression levels of two genes in 12 different tissues, such as heart and liver, were detected by quantitative real-time PCR. The results showed that the CDS region of PPARα was 1 407 bp, encoding 468 amino acids, and the CDS sequence of PPARγwas 1 515 bp, encoding 504 amino acids in Landrace. The two proteins belong to the same family, and the main secondary structure is the helix and random curl, which do not contain the transmembrane region, and are hydrophilic proteins. It was found by real-time quantitative PCR that PPARα was the most expressed in liver of Landrace and the least expressed in the spleen. The expression of PPARγ in adipose tissue of landrace was the highest, followed by that in stomach, the results suggest that the two genes play an important role in energy metabolism, especially glycolipid metabolism. In this study, we successfully cloned the PPARα and PPARγ CDS sequences of Landrace, constructed the eukaryotic expression vector, and analyzed its biological information and tissue expression characteristics.
Keywords: PPARα; PPARγ; Landrace; Gene cloning; Sequence analysis
（责任编辑：周会会）（上接186页）
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