张大仙直播违规杨梦香;柴方超;周前进;苗亮;黄光亮;陈炯
【摘 要】A novel LAMP-LFD method for rapid detection of Vibrio fluvialis was developed based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) integrated with visual detection by a lateral flow dipstick assay (LFD).Six primers were designed according to the conserved regions of ompU gene (among the primers,the forward inner primer was biotinylated),and a specific probe was figured out based on the conserved fragment amplified by both outer primers which was labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC).Then a biotinylated LAMP assay was carried out and the amplicon was hybridized exclusively with the FITC-labeled probe,and the hybrid product was visualized via LFD.The results demonstrated that LAMP-LFD could specifically detect V.fluvialis,and no characteristic amplification was observed when using genomic DNA of Vibrio spp.(like Vibrio vulnificus) and several other aquatic pathogens (like Edwardsiella tarda).The optimized LAMP assay to detect V.fluvialis was performed at 63 ℃ for 25min,and for only 35min when incorporated 5-min'hybridization and
3-5-min'visualization via LFD.The detection limit of LAMP-LFD was 1.0×l02 CFU/mL for V.fluvialis pure cultures and 5× 102 CFU/mL for V.fluvialis contaminated tissues of large yellow croaker.The LAMP-LFD was less device-dependent and only simple isothermal equipment was provided.Therefore,the LAMP-LFD method is easy-operation,less device-dependent,sensitive,and rapidly,showing great potential in the routine detection and monitoring of V.fluvialis.%以河流弧菌(Vibrio fluvialis)为检测对象,将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)联合应用,建立了快速便捷的LAMP-LFD方法.该方法以河流弧菌的外膜蛋白ompU基因作为检测靶标,在其保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),并在两条外引物的有效扩增区段内设计1条特异性探针,由异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记.使用引物进行有生物素标记的LAMP反应,产物与FITC标记的探针完成杂交,杂交产物在LFD上进行结果展示.结果表明,LAMP-LFD方法可特异性地检出河流弧菌,对近似物种如创伤弧菌等弧菌病原以及迟缓爱德华菌等其他水产养殖病原的检测均呈阴性.经优化,LAMP的反应条件为63℃反应25min,加上5min的探针杂交和3-5min的LFD显,整个检测时程约35min.利用该方法最低可检测到1.0× 102 CFU/mL的河流弧菌纯培养物,
能够从污染强度为5.0×102 CFU/mL的组织样品中检测到该病原.该方法设备依赖性更低,仅需简单的恒温加热设备即可完成.因此,本研究建立的河流弧菌LAMP-LFD方法,具有操作便捷,设备依赖性低、灵敏度高和检测快速等优点,在河流弧菌的基层检测中具有良好的应用前景.
【期刊名称】《海洋与湖沼》
【年(卷),期】2017(048)002
【总页数】9页(P383-391)
曹操是哪里人【关键词】河流弧菌;ompU基因;环介导等温扩增技术;横向流动试纸条;检测
【作 者】杨梦香;柴方超;周前进;苗亮;黄光亮;陈炯
科目二怎样倒车入库【作者单位】宁波大学海洋学院 宁波315211;宁波大学海洋学院 宁波315211;宁波大学海洋学院 宁波315211;宁波大学海洋学院 宁波315211;宁德市水产技术推广站 宁德352100;宁波大学海洋学院 宁波315211
【正文语种】中 文
【中图分类】S941.42
河流弧菌为嗜盐性革兰性阴性菌, 广泛分布于河流和近海口水域, 可导致鱼虾贝等多种水生动物患病, 是海水养殖的主要病原菌之一(Baffone et al,2001)。同时, 河流弧菌可从不同水体、城市污水、动物和人类粪便, 以及水产品中分离得到, 感染后导致人出现严重的水样腹泻, 伴随呕吐、腹痛、发烧, 以及不同程度的脱水等症状(Chowdhury et al, 2012;Ramamurthy et al, 2014)。在美国, 该细菌还被认为是引起婴儿小肠结肠炎的重要病原之一(Bellet et al,1989)。因此, 河流弧菌已成为一种重要的全球性人兽共患病病原菌, 不仅危害水产养殖业的发展, 而且对人类健康和食品安全也构成了严重威胁, 因此亟待建立灵敏、快捷、特异的检测技术用于基层检测。
目前, 河流弧菌的检测以传统的细菌分离培养、生化鉴定为主, 但是该方法存在检测周期长、费时费力等缺点, 而且检测人员需要专业的知识背景, 远不能满足疾病的快速诊断和及时。尤其, 该病原菌被认定为人兽共患病病原菌, 使得对于该病原的快速准确鉴定变得更加重要。因以蛋白或核酸为检测靶标的分子检测技术具有检测快速、高灵敏度等优点,在
病原微生物的诊断和鉴定等领域得到广泛使用,但关于河流弧菌分子检测技术的报道还很少。基于PCR原理的核酸扩增技术均以toxR基因作为检测靶标(Chakraborty et al, 2006; 曹际娟等, 2008; 文万侥等, 2009; Vinothkumar et al, 2013)。其中, 曹际娟等(2008)将 PCR技术与高效液相谱联合应用于河流弧菌的检测, 也取得了较好的效果。鄢庆枇等(2006)使用灭活的河流弧菌抗原制备了效价较高的特异性抗血清, 利用该血清建立了河流弧菌的荧光抗体检测技术应用于牙鲆(Paralichthys olivaceus)体内该病原的检测。已有的这些方法存在着对实验设备要求高、工作环境严格等局限性, 仅限于实验室诊断, 不能很好地在基层检测中普及推广。
男孩英文名字大全2013环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)自被报道以来, 凭借其低设备依赖性、高灵敏度和特异性等优势, 在病原微生物的检测领域取得了巨大成功(Niemz et al, 2011; Mori et al, 2013)。但该方法在检测过程的某些阶段仍存在很大的提高空间。如何做到在有效、准确判读结果的基础上, 使得产物的检测过程也脱离对仪器设备的依赖, 是 LAMP方法改进性研究的重要方向。LAMP-LFD技术的原理是将LAMP的反应产物与特异性的探针杂交, 通过荧光素标记在横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)上完成显和结果判读。该方法无需EB等有毒试剂, 也摆脱了对仪器设备的依赖, 特异性探针可极
钟欣桐绯闻大程度地降低了产物的假阳性。该项技术目前已成功用于 ISKNV (Infectious spleen and kidney necrosis virus, 传染性脾肾坏死病毒) (Ding et al, 2010)、IMNV (Infectious myonecrosis virus, 传染性肌肉坏死病毒) (Puthawibool et al, 2009),以及海豚链球菌(Strepstococcus iniae)等水产病原微生物的检测(王瑞娜等, 2014)。
作者在本文中根据河流弧菌外膜蛋白 ompU基因的保守区, 设计出3对引物和1条异硫氰酸酯荧光素标记的探针, 优化反应条件后, 建立了LAMP-LFD技术, 以期为河流弧菌的现场即时检测提供一种便捷可靠的方法。
1 材料与方法
1.1 菌种
河流弧菌(Vibrio fluvialis ATCC 33809)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila ATCC 7966)、哈维氏弧菌(V. harveyi ATCC 33866)和创伤弧菌(V. vulnificus ATCC 27562)购自中国普通微生物菌种保藏中心; 迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda MCCC 235)由中国海洋微生物菌种保藏管理中心惠赠; 溶藻弧菌(V.alginolyticus ATCC 17749)、海豚链球菌(Streptoc
occus iniae ATCC 29178)购自美国菌种保藏中心; 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)购自广东省微生物菌种保藏中心; 鳗弧菌香鱼分离株(V.anguillarum ayu-H080701)为本实验室保存的菌种。其中, 河流弧菌ATCC 33809用于LAMP-LFD的条件优化和灵敏度分析实验。
1.2 方法
贾晓晨 樊少皇1.2.1 细菌的培养与基因组DNA制备 将实验所需的各弧菌从–70°C取出后, 在TCBS固体培养基上划线接种, 28—30°C培养12—24h后, 挑取单菌落于碱性蛋白胨水中震荡培养至所需浓度; 海豚链球菌、迟缓爱德华菌、嗜水气单胞菌和单增李斯特菌划线接种于LB或BHI固体培养基, 于30°C或37°C培养后,挑取单菌落, 于LB或BHI液体培养基中震荡培养至所需浓度。
新鲜培养的各细菌菌株, 菌落计数后调整浓度至1.0×108 cfu/mL, 作为起始浓度。分别取所需浓度的各实验菌株新培养液1mL, 按照基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) D3350-01 (Omega Bio-Tek, USA)提取基因组DNA, 溶解于50 μL的无菌ddH2O用于PCR和LAMP实验。
1.2.2 引物设计 选择已在 NCBI公布的河流弧菌的外膜蛋白ompU (登录号: KC182592)基因, 序列比对分析后, 在保守的基因区段设计3对特异性引物(外引物 VflompU-F3和 VflompU-B3, 内引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP, 环引物 VflompU-LF和VflompU-LB)用于LAMP反应; 同时, 设计1条探针VflompU-HP, 可与LAMP产物特异性杂交, 并用于LFD检测, 见表1和图1。其中探针VflompU-HP的 5′端进行异硫氰酸荧光素标记, 内引物 VflompUFIP的5′端进行生物素标记。以上探针和引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。另外, 将外引物VflompU-B3和VflompU-F3也作为PCR扩增的特异性引物, 扩增预期片段大小约为278bp。
1.2.3 LAMP的反应条件确立 以各供试细菌的基因组DNA为模板, 参考文献的方法建立LAMP反应体系(Ding et al, 2010), 具体组成如下(25µL): 外引物VflompU-F3和VflompU-B3各0.2µmol/L, 内引物VflompU-FIP和 VflompU-BIP各 1.6µmol/L, 环引物VflompU-LB 和 VflompU-LF各 0.4µmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8) 20mmol/L, KCl 10mmol/L, MgSO4 6.5mmol/L, (NH4)2SO4 10mmol/L,Triton X-100 0.1%, 8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2µL样品模版。Bst DNA聚合酶能够在一定的温度范围(60—65°C)保持其最佳活性, 根据实验室已有的研究结果结合文献报道, 得出 63°C和65°C在研究
中最常使用。本研究将LAMP反应的温度设定为 63°C, 在此基础上筛得了 LAMP引物。在上述LAMP体系中添加EvaGreen、SYTO 9等荧光染料后, 通过类似于荧光定量 PCR反应的方式进行LAMP结果的判断(定义为实时荧光LAMP反应), 即反应的实时曲线特征, 荧光强度等能够直观的显示LAMP反应的情况。研究证实, LAMP反应阳性扩增的起始时间与模板的添加量具有明显的相关性(Zhouet al, 2014)。为确定本研究的LAMP反应时间, 我们首先将起始浓度1.0×108 CFU/mL以10倍浓度梯度进行稀释, 将所获各不同浓度的菌液按步骤 1.2.1的方法提取基因组 DNA, 以此为模板, 进行实时荧光LAMP反应, 反应时间为60min。根据LAMP反应阳性扩增的起始时间结合荧光曲线到达平台期的时间,初步分析模板浓度对于 LMAP反应的影响。在此基础上, 选择较低浓度的细菌基因组 DNA为模板, 将接近于该浓度下获得的阳性扩增起始时间作为最短反应时间, 以5min作为时间间隔逐步延长反应时间,进行多次 LAMP反应, 确定 LAMP反应的最佳反应时间。反应产物分别经1.5%的琼脂糖凝胶电泳、LFD,以及在反应产物中添加SYBR Green I荧光染料等方法进行结果判断。
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