第 6 卷 第 6 期2020 年 12 月
生物化工
Biological Chemical Engineering
Vol.6 No.6
Dec. 2020
流感病毒裂解疫苗中游离甲醛残留量的
不确定度评定
冯雪，徐志强，张雪楠，赵琳，裴友财，杨红育*
（长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春 130012）
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对不同待测浓度样品的影响。方法：依据不确定度评定的指导性文件，分析测量过程中引入的不确定度来源，合成标准不确定度及获得测量结果的扩展不确定度。结果：待测样品浓度较低时，标准曲线拟合是不确定度的主要来源；随着待测样品浓度的升高，标准曲线拟合引入的不确定度逐渐减小。结论：建议尽量选用不确定度较小的标准溶液，进行多次重复测量，从而提高测量的精密度、准确度。
关键词：不确定度；游离甲醛；流感病毒裂解疫苗
中图分类号：R392-33 文献标识码：A
Evaluation of Uncertainty in the Determination about Free FormaLdehyde in InfLuenza
Vaccine (SpLitVirion)
FENG Xue, XU Zhiqiang, ZHANG Xuenan, ZHAO Lin, PEI Youcai, YANG Hongyu*
(Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd., Jilin Changchun 130012)
Abstract: Objective: To establish the uncertainty evaluation method for the determination of free formaldehyde residue in influenza virus split vaccine by headspace gas chromatography, and analyz
e the influence of measurement uncertainty on samples with different concentrations. Methods: according to the guidance document of uncertainty evaluation, the sources of uncertainty introduced in the measurement process were analyzed, and finally the standard uncertainty and expanded uncertainty of measurement results were synthesized. Results: the main source of uncertainty was standard curve fitting when the sample concentration was low; the uncertainty introduced by standard curve fitting decreased with the increase of sample concentration. Conclusion: it is suggested that the standard solution with less uncertainty should be selected as far as possible to carry out repeated measurement for many times to improve the precision and accuracy of measurement.
Keywords: uncertainty; free formaldehyde; influenza virus split vaccine
流感病毒裂解疫苗主要用于预防由流感病毒引起的流行性感冒。在生产过程中，一般加入适宜浓度的甲醛溶液进行病毒灭活。因此，游离甲醛是疫苗检测的一个重要指标。目前，测定游离甲醛的主要方法有电化学法、分光光度法、液相谱法、气相谱法等[1-7]。本文根据CNAS-GL006:2019《化学分析中不确定度的评估指南》[8]和JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[9]规定的方法，对顶空-气相谱法测定流感病毒裂解疫苗中游离甲醛残留量不确定度进行分析，为提高测量结果的准确性和精确度提供参考。
作者简介：冯雪（1984—），女，吉林长春人，硕士，医学生物工程师，研究方向：生物制品质量检定。
通信作者：杨红育（1966—），男，吉林长春人，本科，高级工程师，研究方向：生物制品质量管理。E-mail：*****************。文章编号：2096-0387（2020）06-0054-04
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冯雪等：流感病毒裂解疫苗中游离甲醛残留量的不确定度评定
1材料与方法
1.1试剂与材料
流感病毒裂解疫苗，长春生物制品研究所有限责任公司；100 μg/mL水中甲醛溶液标准物质，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司。
1.2仪器设备
7890A型气相谱仪，配FID检测器，7697A顶空自动进样器，谱柱DB-1301（30 m × 0.320 mm，
0.25 μm），Agilent TechnoLogies公司。
日剧开车最多的电视剧1.3实验条件
1.3.1顶空条件
顶空平衡温度100 ℃，平衡时间30 min；定量环温度110 ℃，传输线温度120 ℃。
1.3.2谱条件
进样口温度200 ℃，检测器温度250 ℃，柱温 60 ℃；保持时间10 min，恒定流量1.0 mL/min，分流比为20∶1；空气流量400 mL/min，氢气流量35 mL/min，尾吹 流量25 mL/min；载气为高纯氮气，纯度不小于99.999%。
1.4测定方法
1.4.1标准溶液的制备及测定
量取100 μg/mL水中甲醛溶液标准物质，用超纯水稀释，配制成浓度为0.001 μg/mL、0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.020 μg/mL、0.040 μg/mL的标准系列溶液。取标准系列溶液1.0 mL分别置于顶空瓶中，顶空盖密封。按实验条件进行测定。
1.4.2样品测定
量取样品1.0 mL置于顶空瓶中，顶空盖密封。按实验条件进行测定。
1.5数学模型
1.5.1计算公式
样品中游离甲醛残留量的计算公式如式（1）所示：
C=C i（1）式（1）中，C为待测样品中游离甲醛的质量浓 度，μg/mL；C i为从标准曲线上计算出的游离甲醛的质量浓度，μg/mL。
1.5.2不确定度来源分析
从测定过程分析，测量不确定度主要来自以下4个方面：（1）重复测量样品引入的不确定度；（2）标准物质引入的不确定度；（3）标准系列溶液配制过程引入的不确定度；（4）标准曲线拟合引入的不确定度。依据JJF1059.1-2012规范，分析不确定度性质可知，重复性测量引入的不确定度采用A类不确定度评定，其余分量采用B类不确定度评定[10-11]。
2结果与分析
2.1不确定度评定u rel(A)
2.1.1 A类不确定度评定陆毅的老婆
A类不确定度主要由样品重复测定引入，为获得样品重复测定的不确定度分量，对两批流感病毒裂解疫苗及不同浓度的样品溶液分别进行3次重复测量，根据公式（2）和（3）计算相对标准不确定度，结果见 表1。
x
u=（2）
()
()()
A X=
rel rel
u
u u
x
=
（x）
（3）2.1.2 B类不确定度评定u rel(B)
2.1.2.1标准物质引入的不确定度
连衣裙款式根据标准物质证书，相对扩展不确定度为5%，k=2，因此标准物质引入的相对标准不确定度为
5%
==2.5%
2
rel
u（标物）。
2.1.2.2标准系列溶液配制过程引入的不确定度
标准系列溶液配制过程使用了0.1 mL、0.5 mL、
表1样品重复测定及相对标准不确定度结果
序号样品批号或样品浓度/（μg/mL）平均残留量x—/（μg/mL）标准偏差S（x）/（μg/mL）相对标准不确定度u rel（A）/% 1201807120.001 672 620.000 083 642 4 2.90 2201807180.003 479 490.000 165 196 0 2.80
30.0060.006 318 270.000 265 597 3 2.50
40.0100.009 893 790.000 168 204 80.99
50.0200.019 328 730.000 097 873 90.30
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生物化工2020
年
rel u （标液）
（4）
5.0 mL分度吸量管，100 mL容量瓶，1 mL单标线吸量管。根据校准证书，玻璃量具引入的不确定度见表2。
在标准系列溶液配制过程中，使用0.1 mL 分度吸量管1次，0.5 mL 分度吸量管1次，5 mL 分度吸
量管1次，1 mL 单标线吸量管2次，2 mL 单标线吸量管1次，100 mL 容量瓶6次，由表2数据合成的相对标准不确定度如公式（4）所示。
表2 标准溶液配制中玻璃器具引入的不确定度玻璃量具测量结果不确定度
U /mL（k =2）
相对标准不确定度0.1 mL 分度吸量管0.002u rel （V 1）=0.010.5 mL 分度吸量管0.002u rel （V 2）=0.0025.0 mL 分度吸量管0.009u rel （V 3）=0.00091.0 mL 单标线吸量管0.002u rel （V 4）=0.0012.0 mL 单标线吸量管0.004u rel （V 5）=0.001100.0 mL 容量瓶
0.040
u rel （V 6）=0.0002
2.1.2.3 标准曲线拟合引入的不确定度
实验中对每一浓度的标准溶液分别测定3次，得到相应的峰面积。用最小二乘法对浓度和峰面积进行拟合，得到直线方程y =a x +b 及其相关系数，结果详见表3。
表3 标准系列溶液浓度与对应的峰面积
标准溶液浓度/（μg/mL）
3次测定的峰面积 平均值（pA×s）
线性回归方程
相关系数
0.0010.684 53y =561.893 46x -0.044 414 2r =0.999 71
0.005 2.795 000.010 5.515 000.02010.816 000.040
22.627 00
根据公式（5）~（7）计算出测定不同浓度样品时，由标准曲线拟合引入的不确定度，计算结果见表4。
S （5）
(u 标曲 （6）
()
()=
rel u x
标曲标曲 （7）
式（5）~（7）中，A i 为标准溶液各浓度测定所对应的峰面积；C i 为标准溶液的浓度，μg/mL；s 为
标准溶液待测物质残差的标准差，s =0.128；a 为标准曲线的斜率，a =561.893 46；p 为同一样品测定的次数；n 为标准溶液测定的总次数，共测定了5种不同浓度的溶液，每种浓度测定3次，n =5×3=15；x —
为测定样品中游离甲醛的平均浓度，μg/mL；c —
为标准溶液的平均浓度，1
=
2
c (0.001 0+0.005 0+0.010 0+ 0.020 0+0.040 0)=0.015 2。
表4 标准曲线拟合引入的不确定度
李真旭主演的电视剧序号样品批号或样品浓度/
（μg/mL）
相对标准不确定度 u rel （标曲）/%
12018071215.262201807188.3530.006 4.0740.010 2.395
0.020
1.19
2.1.3 相对合成标准不确定度u rel (c )
综合上述各不确定度分量，根据公式（8）计算相对合成标准不确定度，结果见表5。
()
c rel u
（8）
2.1.4 扩展不确定度与结果表示
加藤英美里按照一般惯例，取包含因子k =2，则相对扩展不确定度为U rel =u rel （c ）×2。流感病毒裂解疫苗（批号
20180712）的测量结果为0.001 672 62 μg/mL，U rel = 31.54%；流感病毒裂解疫苗（批号20180718）的测量结
果为0.003 479 49 μg/mL，U rel =18.44%；0.006 μg/mL 的样品溶液测量结果为0.006 318 27 μg/mL，U rel =
11.00%；0.01 μg/mL 的样品溶液的测量结果为 0.009 893 79 μg/mL，U rel =7.50%；0.02 μg/mL 的样品溶液的测量结果为0.019 328 73 μg/mL，U rel =5.96%。
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冯雪等：流感病毒裂解疫苗中游离甲醛残留量的不确定度评定
3结论
本研究从测量过程着手，识别和量化了各个来源的不确定度，并讨论了待测物浓度不同时，各分量对总不确定度的影响。结果表明，当待测浓度较低时，标准曲线拟合对测定结果影响最大，重复测量及标准物质影响次之；随着待测物浓度的提高，标准曲线拟合对测定结果的影响逐渐减小。因此，可以增加标准系列溶液试验点数，选用不确定度较小的标准溶液，进行多次重复测量，从而降低测量不确定度，提高测量的精密度及准确度。
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表5样品的不确定度分量
不确定度来源符号
不同样品的相对标准不确定度/%
12345
重复测量u rel（A） 2.90 2.80 2.500.990.30标准物质u rel（标物） 2.50
标准溶液配制u rel（标液） 1.05
标准曲线u rel（标曲）15.268.35 4.07 2.39 1.19相对合成标准不确定度u rel（c）15.779.22 5.50 3.75 2.98扩展不确定度U rel31.5418.4411.007.50 5.96
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