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•综述.新型冠状病毒靶点的研究进展
崔舒萍1葛子若2王先堃2陈志海2
^匕京大学地坛医院教学医院感染二科100015; 2首都医科大学附属北京地坛医院感
姜虎东刘在石染二科 100015
通信作者：陈志海，Email:chenzhihai0001@126
【摘要】新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2 )是国
际公共卫生的重大威胁，其在基因组学与SARS-C〇V高度同源。针对SARS-CoV-2感染尚无针对
性方法，故了解病毒结构，阐明并利用它们的复制机制筛选靶点是值得关注的课题。本
NF-kB和IL-6-STAT3通路中的关键分子作为耙点加以综述，为药物及疫苗设计提供基础。
【关键词】SARS-CoV-2、SARS-C〇V、耙点、中和抗体七个人有八只眼
基金项目：新冠肺炎病人排毒规律与新冠病毒环境耐受性研究（2020YFC0846200)
D0I：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2021.02.020
新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2)属p冠状病毒属，核苷酸长 度为29.9 k h，存在11个功能基因编码结构蛋白、非结构 蛋白和辅助蛋白，结构蛋白包括刺突蛋白（spike proteins, S)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。S蛋白是冠状病毒 诱发中和抗体的主要抗原，是研究疫苗很好的靶点。非结 构蛋白包括3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶[又称主蛋白酶（main protein, M pro)】、木瓜蛋白酶样蛋白酶、解旋酶和RNA 依赖性RNA 聚合酶（RNA-dependent KNA polymerase, RdRp) f11，其中Mpro与RdRp为最具特征的药物靶标。SARS-CoV-2全基因组序列与严重急性呼综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronaviras, SARS—CoV ) 一致性约79.5%，且两种病毒均以血管紧张素转换酶II (angiotensin converting enzyme II, ACE2)为受体 12丨。分析 研究该病毒识别受体和感染宿主的分子基础，筛选开发靶 向药物是当务之急。本综述总结目前SARS-C〇V-2相关药物靶点的研究结果，为将来研究提供基础。
1靶向S蛋白的中和抗体
S蛋白在功能上分S1亚基和S2亚基，S1亚基中的受 体结构域（receptor binding dom ain, RBD )可与ACE2 结合，且RBD是中和抗体的主要靶标。新冠肺炎恢复期患者血浆 中含有适应性免疫反应产生的中和抗体，对新冠肺炎有一 定疗效，但血浆来源有限且中和抗体滴度低，因此，研发 易于生产与质控的单克隆中和抗体可能是新冠肺炎的 “特效药”。本文将目前SARS-C〇V-2中和抗体的研究整 理如下（表1)。
1.1 来源于SA R S恢复期患者
由于SARS-CoV-2和SARS-CoV基因序列的高度同源 性，评估抗SARS-C(>V抗体与SARS-C〇V-2 S蛋白之间的 交叉反应，有利于SARS-C〇V-2疫苗和性抗体的快速 研发。CR3022和S309均是从恢复期SARS患者中分离出 来的耙向RBD的中和抗体，在RBD的结合位点与ACE2
表1靶向SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体
抗体来源抗体名称与SARS-CoV是否发生交叉反应是否阻断受体结合是否受D614G突变影响SARS恢复期患者CR3022是否否
S309是否否
新冠肺炎恢复期患者P2C-1F1K P2B-2F6否是否
BD-368-2N A是否
B38、H4否是否
4A8N A否N A
全人源小鼠杂交瘤库47D11是否N A
人源化单域抗体噬菌体库N3130、n3088NA否N A
RBI)免疫马血清Horse F (ab' ) 2NA NA否
注：NA 为未见相关报道
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不重叠，即抗体对SARS-CoV-2的中和机制并不依赖于直 接阻断RBD与ACE2结合|M|。Yuan等|5丨发现CR3022的抗体结合位点隐藏在病毒内部且高度保守，提示我们尚有 待发现的抗体可有效中和两种病毒。S309中和抗体识别 RBD的24个氨基酸残基在所有已知的SARS-C〇V-2突变株 中均未发生突变，其中19个氨基酸残基与SARS-CoV相同，因此，S309有可能成为一种冠状病毒广谱的中和抗体\
1.2 来源于新冠肺炎恢复期患者
Ju等161从8例新冠肺炎恢复期患者的单个B细胞中分 离并鉴定出206个特异性耙向KBD的单克隆抗体，其中中和 活性最强的是P2C-1F11和P2B-2F6, 2种抗体可分别将KBD 与ACE2的结合降低约99.2%和98.5%。Wu等m分离出4种 具有中和作用的人源单克隆抗体（B38、H4、B5和H2)，均 靶向SARS-CoV-2 RBD。其中B38和H4抗体识别RBD不同 表位但均可完全阻止SARS-C〇V-2 S蛋白RBD的受体ACE2 结合，且B38和H4具有协同中和能力，表明2种抗体在临 床上为较理想的病毒中和抗体，可避免免疫逃逸。另外，Can 等m通过高通量单细胞测序成功分离出的BD-368-2，在小鼠 模型中显示BD-368-2除显著降低病毒载量外，还具有预防 性保护作用，为SARS~C〇V-2药物及疫苗设计提供了基础。
目前SARS-CoV-2中和抗体研究主要靶向S蛋白 RBD, Chi等191对10名新冠肺炎恢复期患者的B细胞和浆 细胞初筛发现4A8抗体靶向SARS-CoV-2 S蛋白NTD，该 抗体具有较强的病毒中和能力。4A8与RBD靶向抗体联合 方法可有效避免病毒的逃逸突变。
1.3 来自现有抗体库筛选
Wang 等丨1。1使用SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV- OC43的S蛋白免疫H2L2人源小鼠，发现产生的47D11可同时中和SARS-CoV-2和SARS-CoV，随后将嵌合47D11重组表达为完全人源Ig G l同型抗
体。该抗体并不 能阻断RBD与ACE2结合，推测其可能与RBD的保守结 构域结合，起到中和病毒的作用。WU等1111将全人源化 的重链可变区抗体骨架进行筛选重构，并以SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白为抗原，筛选出靶向多类表位的纳米抗体，其中n3088和n3130抗体与CR3022相似粑向S蛋白特殊 的隐藏表位，提示靶向该表位的全人源纳米抗体也可能具 有较好的广谱性。此外，有研究以KBD为免疫抗原使用 马等大型动物通过被动免疫产生的抗血清，使用胃蛋白酶 消化、纯化、分离获得免疫球蛋白片段F U b’）2，中和试验发现F (a h’）2对SARS-CoV-2具有抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系，所以RBD特异性的F U b’）2可作为SARS-CoV-2的候选药物|121。
SARS-CoV-2具有高突变性，研究发现使其传染性增 加的D614G突变型病毒株可降低新冠肺炎康复期患者血清 对病毒的敏感性，但该突变并不位于RBD区域，不太可能 对正在研制的疫苗疗效产生重大影响|131。除此之外，要进一步研究SARS-CoV-2中和抗体是否与SARS-CoV相似存 在抗体依赖的病毒感染增强效应。
2 靶向SARS-CoV-2的重要蛋白—M p ro和RdRp
M pro是一种半胱氨酸蛋白酶，参与病毒复制和转录，因此Mpro是一个抗病毒的关键药物耙点。为快速发现用 于临床的先导化合物，』in等1141设计了该酶不可逆抑制剂 N3，其可特异性抑制多种冠状病毒的Mpnxs, 研究团队对10 000多种临床药物以及天然活性产物进行筛选，发现 了6种抑制MPro的
先导药物，该研究为迅速开发具有临床潜力的抗新冠肺炎的药物奠定了重要基础。另外，Zhang 等1151设计了拟肽a-酮酰胺，作为P和cx冠状病毒以及 肠病毒Mpro的广谱抑制剂，并不断优化其化学结构，开发 成为SARS-CoV-2 M pro的有效抑制剂。该研究为开发含吡 啶酮的抗冠状病毒药物提供了有用的框架。
RdRp是病毒复制、转录的核心组成部分，可催化病 毒RNA合成，是抗病毒抑制剂瑞德西韦的主要靶标。Cao 等^率先解析了全长RdRp与辅助因子非结构蛋白7和 8复合物的冷冻电镜结构，发现除核心保守结构域外，其 N-末端存在一个独特的“P发夹”结构域，该结构域为 阐明SARS-CoV-2 KdRp的生物学功能提供了新的线索。随后研究者解析了R(IRp-RNA-瑞德西韦复合物的电镜结 构，结构显示三磷酸瑞德西韦最终以单磷酸形式共价结合到RNA引物链3'端的+1位置，终止RNA引物链的延 伸，从而阻止SARS-CoV-2遗传物质的复制。该发现揭 示了瑞德西韦抑制SARS-C〇V-2RdRp活性的机制，为靶 向RdRp的新型药物筛选以及药物设计提供了基础M71。
3宿主细胞靶点一A CE2和HSPGS
ACE2是病毒侵染细胞的受体，其在体外结构不稳定，B0AT1是一种中性氨基酸转运蛋白，可与ACE2形成 稳定复合物。Yan等"8|在ACE2-B0AT丨复合物三维结构 中RBD结合位点附近存在3个糖基化位点，糖基化可使 病毒逃过人体免疫细胞识别和攻击。最近，W an等1191报 道SARS-CoV-2 KBD的49
3残基、501残基对应于SARS- CoV中的479残基、487残基，可分别被ACE2病毒结合热点LyS31、LyS353识别，如果病毒结合热点突变将影响 其与受体ACE2结合，所以结合热点是重要的抗病毒靶点。Lei等m将人ACE2胞外区与IgG l的F c区连接构建重组 蛋白A C E2-Ig，对SARS-CoV-2和SARS-CoV具有显著中 和作用，可作为阻断病毒入侵细胞的抑制剂。
研究发现乳铁蛋白通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋 白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPGs )结合抑制SARS-CoV人侵细胞，且不影响S蛋白与ACE2的相互作用。使用肝素酶或外源肝素可以阻止S蛋白与宿主细胞结合并 抑制SARS假病毒感染。这表明除ACE2外，HSPGs是参 与SARS-CoV人侵的重要细胞分子，使用性抗体阻断 细胞上的HSPGs有可能是新冠的另一种策略|211。
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4病毒感染后期潜在的药物靶点
以上药物靶点仅在感染早期阻止病毒侵人细胞增殖，但细胞因子风暴引起的急性呼吸窘迫综合征出现在感染后 期。研究发现病毒人侵细胞后识别细胞的模式识别受体，进 而激活下游的核转录-kB (iiiirlear factor-kappa B,NF-kB)通路。随着病毒感染，ACE2被降解，血清血管紧张素II升高，激活血
管紧张素受体1 (angiotensin receptor 1, ATR1 )，导致蛋白质分解酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17)被活化，ADAM17可剪切月中瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a，TNFa)前体、白介素 6 受体 o t (interleukin-6 rec_cpt〇ra,IL-6R a)为TNFa、IL-6，并与其他炎症相关分子 进一步激活信号传导和转录激活因子（signal Transducer aral Activator of Transcription3，STAT3 )。该过程中过度激活的 NF-kB和丨L-6-STAT3炎症途径可引起细胞因子释放综合征，导致肺水肿等急性肺损伤症状。其中ATR1、ADAM17、TNFa等都有望作为研发药物的粑标|221。
5小结
针对SARS-CoV-2的靶点，目前研究较多的是中 和抗体，主要在SARS或新冠肺炎恢复期患者的B细胞以 及现有抗体库中筛选。考虑冠状病毒的高频率突变型，筛 选靶向保守结合表位的中和抗体尤为重要，但即使识别保 守结合表位的中和抗体也无法识别所有突变病毒，所以“鸡 尾酒疗法”将提供一种新的策略。而且Mpro、RdRp 作为病毒关键酶也是抗病毒的药靶。在疾病感染早期，宿 主细胞表面分子以及TMPRSS2拮抗剂发挥重要作用，但在 疾病后期NF-k B和II.-6-STAT3通路中的关键因子也是抗 病毒的潜在药物耙点。目前，针对SARS-C〇V-2的药物及 疫苗研究仍面临着诸多挑战，但研发更多物靶点 仍是对抗新冠肺炎强有力的手段。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期：2020-06-09)
(本文编辑：田祎）
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