中国生物工程杂志China Biotechnology，2020,40(12):l-7
D01：10. 13523/j.cb.2011032 |新型冠状病毒检测与|
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十大黄酒品牌重组人干扰素alb抗新型冠状病毒的
林福玉刘金毅程永庆#
刘涛的电视剧都有哪些(北京三元基因药业股份有限公司北京102600)
摘要干扰素是机体抗病毒的第一道天然防线，干扰素c d b是中国人干扰素家族中主要的抗病毒表达亚型。SARS-C〇V-2通过多种途径抑制先天免疫关键分子干扰素的产生。已上市多年的重组人干扰素a丨丨）显示出强大的体外抗SARS-CoV-2病毒活性。初步临床研究显示，包括重组人干扰素
a l b在内的I型干扰素对COVID-19显示出积极的和预防作用。全球多个国家正在开展干扰素
COVID-19的临床试验，我国自主知识产权的重组人干扰素a l b率先开展了验证性临床试验。
转行产品经理关键词新型冠状病毒新冠肺炎干扰素a l b预防陈文媛
中图分类号Q819
新型冠状病毒（S A R S-C〇V-2)感染引起新冠肺炎(C O V I D-19)大流行疫情严重威胁全球生命健康。截至 2020年11月25日，W H O数据统计显示，全球已超过5 890万人确诊感染，超过139万患者死于S A R S-C〇V-2感染®。目前尚无严格临床试验证实C O V I D-19有 效的药物。针对特定病毒或特定耙点的抗病毒用药如 瑞德西韦[1]、氯喹或羟氯喹[2]等C O V1D-19无效的 报道引发争议，尽管瑞德西韦在2020年10月已被F D A 批准为E U A药物，但其疗效仍有待进一步严格的临床 试验证实。国家卫生健康委员会等连续印发的第一至 第八版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》推荐雾化吸入a-干扰素（IFN)®。从病毒感染的防御机制看,IFN-a是 一种天然的广谱抗病毒细胞因子，对未知或新发病毒感染具有先天免疫防护作用。体外研究和初步的临床 研究中显示了 IFN-c(对S A R S-CoV-2病毒的抑制作用，是一种具有潜力的新选择。中国自主知识产权的重组 人干扰素a l b率先进人验证性临床试验阶段，其进展收稿日期:2020-11-17 修回日期:2020-11-27
*通讯作者，:ycheng@triprime
①[2020-11-25 ]. https ://c o v id l9. who. int/
②w w w. gov. cn/zhengce/zhengceku/2020~08/19/content _5535757.htm 备受关注。
1 IF N是病毒诱导出的机体第一道天然抗
病毒防线
目前发现的人类干扰素家族包括I型、II型和m 型，其中I型IF N包括IFN -a和IFN-(3等13个成员，是 在病毒的诱导下产生并在早期发挥抗病毒功能的主要 细胞因子，为机体提供了第一道防线。丨型1F N是在 先天性模式识别受体（P R R)检测到病原体相关分子模 式（PA M P)和损伤/危险相关分子模式（D A M P)之后诱 导表达的。P R R由免疫细胞和非免疫细胞共同表达，包含T o ll样受体（T L R)、C型凝集素受体（C L R)、视黄 酸-诱导基因1(R1G-1)样受体（R L R)、核苷酸结合寡聚 域（N O D)样受体（N L R)、A im2样受体（A L R)和环状 GMP-AMP合酶（cG A S)，它们结合细胞内外多种PAMP 和DAMP。P R R感知的病毒感染信号主要通过RIG-1- MAVS-TBK1-1RF3、TLR3-TBK1-IRF3、cGAS-STING- TBK1-IRF3等几种信号转导途径来诱导I型丨F N的 表达。
病毒诱导产生的丨型I F N与细胞表面受体结合后，启动多种细胞内信号转导途径，包括经典的Janus激
2中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.40 No. 12 2020
酶-信号转导子和转录激活剂（J A K-S T A T)信号通路和 非经典的p38-丝裂原激活的蛋白激酶（M A P
K)信号通 路、磷酸肌醇3激酶（PI3K)和蛋白激酶B(A K T)信号 通路等，通过信号传导和级联放大，可以诱导细胞内产 生多种I F N刺激蛋白（ISG)[3]，用以抵御病毒对细胞的 感染。同时，I F N作用在免疫细胞上（如自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞和巨噬细胞），可迅速提升这些细 胞的数量和杀伤活力，用以直接清除外来病毒。
几乎所有病毒感染均能够快速诱导I型IF N的产 生,1型IF N对复制周期不同阶段的病毒均有抑制作用，对免疫细胞的激活作用，协同发挥清除病毒感染的 功能，确立了 1型丨F N是机体先天抗病毒免疫的关键成 分，使得I型IF N成为典型的广谱抗病毒候选药物。
2 IF N-olb是天然状态下病毒诱生的主要
IF N亚型
I984年美国学者H aw kins等[4]报道，从m R N A表 达频率上看，IFN-a l应该是自然状态下产生的主要IF N亚型。从基因进化分析角度也可以看到IFN-a l的重要性。在所有lFN-a多基因家族成员中，只有IFN- al 能到另外一个高度同源的蛋白质序列U F N-a13 基因编码，98. 9%—致性），且只有两者在病毒等诱导情况下一起持续协同表达[5]，提示人类细胞中IFN-cxl 蛋白的来源有两个，这种“备份”为保护机体免受病毒 入侵提供了一种可能的选择性优势。另外，在病毒感 染诱导IF N调节因子（IR F)激活下，IF N-c d是唯一与 IF N-p共同表达的IFN-o(亚型，提示IFN-a l是在抗病 毒长期进化中不可或缺
的重要成员。
1982年我国病毒学家侯云德院士在国际上首次报 道从健康中国人脐血白细胞中克隆到W-a M基 因[6]。1993年侯云德院士报道正常人体白细胞经病毒 刺激后诱生丨F N的主要亚型为丨F N-a l，其次是IFN-a2。1980 ~ 1991年，原中国预防医学科学院病毒所从中国人的染体基因库或病毒诱生后建立的cD N A库中，克 隆的主要类型为IFN-a l b和lFN-a l c m，这说明在中国 人的IF N系统中，I F N-a l是主要的，以IFN-ctl b最具代 表性[8]。
以上国内外研究表明，丨F N-a lb是人类IF N系统中 主要的抗病毒表达亚型。作为一种生物制剂或佐 剂，理论上讲，愈接近生理状况的应当是最好的，我国 大量临床研究和实践证实了 IFN-a l b不良反应明显轻于其他IFN。
3 IFN诱生不足与SARS-CoV-2感染密切
相关
[型丨F N的失调/诱导减少能够增加病毒的感染性。细胞水平上，S A R S-C〇V-2感染表达A C E2的A549 细胞后，刺激丨型I F N和I丨I型I F N表达增加的T B K1并没有被激活表达，I型I F N刺激的基因如S T A T1和 M X1等也没有被诱导，表明I F N的反应性降低。组织 水平上，体外组织培养研究％表
明，SAR S-CoV-2在体 外感染离体培养的人的肺组织内诱导的〖F N表达水平 非常低，无法启动对S A R S-C o V-2的先天免疫反应。机 体水平上，C0VID-19患者的肺组织基本检测不到（1、I I 或1丨[型）I F N诱导产生，因此尽管SAR S-CoV-2和 SAR S-C o V具有相同的细胞噬性，SA R S-C〇V-2病毒复制比SAR S-C o V更快，S A R S-C o V-2感染后病毒滴度更高，C0VID-19患者出现症状的5天内，SAR S-CoV-2的 R N A水平达到峰值，高出S A R S病毒1 000倍，且峰值 出现明显早于S A R S病毒[1°]。
IFN诱生不足和延迟致使CoV能够主动自由地复 制。据报道，SARS-CoV-2感染细胞和C0V1D-19患 者[4]中均出现丨型IFN水平低和延迟免疫应答。通过 病毒动力学分析发现，大多数患者口咽部/鼻咽部病毒 复制处于高峰，但症状出现后病毒复制逐渐下降。SARS-CoV-2病毒复制高峰出现在上呼吸道症状（即无 症状感染阶段）之前;"]。因此，没有被充分激活的先天 免疫应答，特别是丨型IFN诱导产生不足，使SARS-CoV-2在临床症状出现前复制到高水平。由于C0VID-19患者呼吸道分泌物中的病毒载量在症状出现时较早 达到峰值，以IFN应答延迟和诱生不足为特征的先天免疫反应特征，为IFNC0VID-19提供了理论依据。因此，使用外源性f f N预防易感个体感染，并在 C0VID-19早期进行，对于抑制病毒的复制和感染 具有重要意义。
最近一项研究表明，1型IFN应答受损以及ISGs表 达减少与严重C0VID-19相关:|2]。与轻、中度C0V1D-19患者相比，危重症患者的血浆IFN-a蛋白水平明显 降低，且所有患者均未检测到IFN-p，这
表明I型IFN 对SARS-CoV-2感染的免疫应答不充分可能决定了其致病性，并解释了与SARS-CoV的差异。不同严重程度 的C0VID-19患者和对照组患者给予外源IFN-a刺激 后，ISG表达升高且升高后的表达水平相似，提示危重
2020,40(12)林福玉等：重组人干扰素ctlb抗新型冠状病毒的基础和临床研究进展3
患者对I型丨FN反应的能力不受影响:12;。IFN-a诱生 不足被认为是血浆病毒载量增加的原因，与轻度到中 度COV1D-19患者相比，血浆病毒载量可能成为重症和 危重患者肺部感染不受控的替代标记。因此，1型IFN 生成受损、对病毒抑制率降低和COVID-19患者进展为 严重或危重状态有关。另一项临床研究显示，约20%的危重COV1D-19患者病毒感染后无法诱导表达I型 1FN，表现为血液中检测不到I型IFN，其他患者IFN随着 时间的推移下降到较低水平，甚至在症状出现的第8 ~ 10 天才出现lFN-a峰值，无法检测到的COV1D-19 患者预后较差[13]。这些研究为补充外源性IFN用于治 疗新冠患者提供了更有利的依据。
4 I型IFN诱生不足的分子机制
病毒能否存活并传播到宿主体内取决于能否避开 宿主的识别和免疫防御。因此病毒主动使用免疫逃避 策略来对抗宿主的防御，特别是对抗机体的先天免疫，如IFN系统和IFN诱导的分子。事实上，哺乳动物相 关的所有病毒都进化出多种免疫逃避机制，通过抑制 宿主I型丨F N的诱导和信号传导，逃避机体
先天免疫应 答得以生存。病毒可以在其基因组中编码多种不同的 蛋白质或单个多功能蛋白质，作用于I型丨F N先天免疫 反应的诱导调控途径中不同的中介蛋白质/激酶，从而 减弱丨型IFN诱导的抗病毒反应。
对于SARS-CoV-2，这种干扰先天免疫反应抑制I 型IFN的机制得以进化保留。目前至少发现五种新冠 病毒表达的蛋白质（ORF%、NSP13、NSP15、ORF3I)、Nspl)可以抑制内源性干扰素的产生。SARS-C〇V-2的ORF9b通过与T〇m70的关联，间接与信号接头蛋白MAVS相互作用，抑制MAVS信号[14]。SARS-CoV-2的NSP13与中间信号蛋白TBK1相互作用。SARS-CoV-2的NSP15与N rdpl可相互作用，N rdpl是TBK1和IRF3 的激活因子，从而间接影响I F N诱导信号通路[14]。SARS-CoV-2的ORF3b是一种强有力的IFN拮抗剂，其 机制可能类似于SARS-CoV的ORF3b，阻止IRF3磷酸 化和核易位。此外，SARS-CoV-2 0RF3b 比 SARS-CoV 更有效地抑制IFN诱导D 2例COVID-19重症病例中分 离到的SARS-CoV-2 0RF3b对丨F N诘抗作用增强:15i。SARS-CoV-2蛋白的N端非结构蛋白1(Nspl)有效阻 断视黄酸诱导基因I (R lG-丨）依赖的IFN诱导通路和 IFN抗病毒应答[|6]。SARS-C〇V-2的其他与SARS-CoV 和MERS-CoV同源的ORF蛋白诘抗丨FN的产生和刺激功能有待进一步比较研究。可以预测，SARS-C〇V-2还 有其他的分子机制来干扰I型IF N的诱导产生和信号 传导以及丨S G的抗病毒活性。
5 IF N-olb体外强效抑制SARS-CoV-2
最近的临床前研究表明，在培养细胞中，S A R S-C o V-2对I型I F N高度敏感[|7]。50国际单位（IU)/ml 浓度的IFN-a可以显著降低Vero细胞中S A R S-C o V-2 病毒滴度。IFN-cx和IFN-(3对感染S A R S-C o V-2病毒的 Vero细胞的体外半数抑制浓度分别为1.35丨U/m l和 0.76IU/mlDS A R S-C o V-2 比包括 SARS-CoV 在内的许多 其他人类致病病毒对人丨型1F N更敏感。在两项独立 的体外药效学研究中，研究人员在Vero细胞上使用人 [F N-a l b显示人IFN-otlb对新冠病毒具有很强的抑制作用。一项研究表明，重组人lFN-a l b在体外有效抑制 SA R S-CoV-2复制，体外半数抑制浓度小于0.059U/ml，治 疗指数（TI)大于423 729。通过与抗病毒药物瑞德西韦和更昔洛韦的抗病毒活性和细胞毒性的比较，发现 重组人IFN-a l b的T I是瑞德西韦的1 000倍，是更昔 洛韦的70 000倍，可见lFN-a l b比瑞德西韦和更昔洛韦在体外对S A R S-C o V-2更有效、更安全（未发表数据）。另一项研究比较了重组人IFN-a l h、重组人IFN-a2b、集成干扰素（丨F N-con)三种I F N体外抑制新型冠状病毒的活性。重组人IFN-o d b、丨F N-a2a和丨F N-a2b 是我国批准为药品在临床使用的丨F N-a的三种亚型，均为基因工程产品。实验结果表明，三种I F N在 lOOng/m l均无明显细胞病变效应。IFN-c d b对S A R S-C o V-2的体外半数抑制浓度小于0. 001 ng/m l，IFN-a2b 对S A R S-C o V-2体外半数抑制浓度为0. 005ng/tnl，集成 I F N对S A R S-C o V-2体外半数抑制浓度为1.02ng/m l，可见重组人lFN-a l b对S A R S-C o V-2的抑制活性最高(图 1)，是 IFN-a2b 的 5 倍，是 IFN-c〇n 的 1 000 倍。此 体外实验测定重组人IFN-a l b的最大无毒浓度为100ng/ml,T I大于100 000，表明IFN-a l b窗很大，安全性好。S A R S-C o V-2对重组人IFN-a l b的显著敏感 性为支持重组人丨F N-a l b用于C0VID-19的临床试验提供了强有力的实验依据。
使用相同的细胞模型（S A R S-C o V-2感染的Vero细 胞）进行的IFN体外研究比较分析发现，我国IFN-alb 对新冠病毒的药效作用明显强于IFN-a2b、IF N-p和集 成 IFN(图 2)。
4
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Yol. 40 No. 12 2020
〇.
0.0001 0.001 0.01 0.1
1
10
100 1000
Concentration(ng/ml)
(b)
IFN-con
Inhibition
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10
丨Of ) 1000
Concentration(ng/ral)
(c)
图1三种IFN 对新型冠状病毒的体外抑制浓度测定
Fig. 1 In vitro SARS-CoV-2 inhibitory concentration
of three interferon
(a ) Inhibitory effect of IFN-alb on SARS-CoV-2 ( b ) Inhibitory
effect of IFN-ct2b on SARS-CoV-2
(c ) Inhibitory effect of IFN-con
on SARS-CoV-2. X-axis is IFN concentration used in study, Y-axis is SARS-CoV-2 virus inhibition rate. Dotted line represents 50% inhibition rate
6 IF N COVID -19的临床研究
雾化吸人重组人IFN-a l h 在我国率先开展了 病毒性肺炎的临床研究。由蒋荣猛等;18：报道164例患 者采用随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床研究显示, 与安慰剂对照组比较，患者症状在5〜
7天后获得 了明显改善，其中部分患者为冠状病毒感染。该研究
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
Concentration(ng/ml)
100
IFN-a2b
-o—a—b —□
Inhibition
IF N -a lb
-B- Inhibition
—〇--p ■ e ■ a
1.2-
1.0-
0.8-. 0.04-r 〇
0.03-
张歆艺和华晨宇为什么好y 〇.〇2-0.01-i 0.006-■
0.004-
0.002-
0.000
1.02
I F N ^l b IFN -a2b IF'N-a2b IFN-P IFN-con
(CHINA) (CHINA) (USA) (USA) (CHINA)
图2 IF N 各种亚型的抗SARS-CoV-2病毒活性比较
Fig. 2 Anti-SARS-CoV-2 activity of
different subtype of IFN
表明雾化吸人[F N -a l b 对于由多种病毒引起的病毒性 肺炎具有作用，可以促进临床症状改善，且安全性
良好。
一个非盲随机丨1期临床试验表明，丨F N -p i b 、洛匹
那韦/利托那韦片和利巴韦林的三联组合C 0VID- 19中，组C 0VID-19患者从开始接受到鼻咽拭 子阴性的中位数时间（7天）比对照组（12天）明显缩短
(P =0.00I 0)、症状减轻时间（N E W S 2 04天对8天） 变短，住院时间（9.0天对14.5天）也明显缩短，但不良
事件（包括自限性恶心和腹泻）两组间无差异。亚组比 较表明，早期使用三联抗病毒，在缓解轻度至中度 C 0VID-19患者的症状、缩短病毒清除时间和住院时间
方面，优于单独使用洛匹那韦-利托那韦。多因素 分析表明J F N -p i h 似乎是联合的关键成分。尽管 IFN-pi b 亚组的患者数量相对较少，显著差异的结果为 I 型I F N S A R S -C o V -2提供了支持依据:19]。单项 病例研究也支持使用I 型I F N C0VID-I 9感染患 者可能有效的观点>。IFN-a 单独雾化或IFN-a 联合
阿比多尔雾化的C 0VID-19患者，均显示上呼吸道 可检测病毒持续时间明显缩短，同时炎症标志物1【-6 和C R P 升高的持续时间也明显缩短;21:。该研究支持 了《中国儿科共识声明》中对感染SAR S -CoV-2的儿童 使用IFN-a 雾化吸人的建议u 。在C0VID-19患者中 观察到的S A R S -C 〇V -2载量的快速下降可能与雾化 IFN-ct有关:23:。IFN-a 雾化C 0V 1D -19临床 研究表明：丨F N -oi的应用使患者体内SAR S -CoV-2的病 毒滴度下降至连续两次P C R 检测限以下，且比阿比多 尔提前7天。IFN-a 雾化吸人联合低剂量系统性糖皮 质激素、洛匹那韦/利托那韦中国深圳新冠肺炎患 者，观察到零死亡率。雾化吸人I F N 还降低了武汉
50
{%)§n !q !M =
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2020,40(12)林福玉等：重组人干扰素抗新型冠状病毒的基础和临床研究进M5
C O V I D-19 患者的死亡率（O R =2. 32，IC95% [ 1. 36;
3.97] ) [24-25]。
重组人IFN-odl】雾化吸人用于S A R S-C<，V-2 的临床试验已获得国家药品监督管理局批准，正在率先开展验证性临床试验。
7 IFNol b预防COVID-19的基础和临床研究
删除评价I F N作为天然免疫的关键细胞因子，是防御病毒入 侵的第一道防线，其抗病毒机制不是直接作用在病毒的某个靶点上，而是系统性地作用于全身各类细胞。研究表明，在使用1F N后，虽然I F N在体内清
除较快，但其激发的抗病毒蛋白可在体内稳定持续多f26，IFN 预先激发的人体全面的抗病毒状态可有效防御病毒感 染。免疫力低下的人不能及时产生足量的内源性IFN-a，使病毒获得复制的机会，这是部分人易发病毒感染性疾病，并逐步趋向重症化的根本原因。所以，提前补充外源IFN-a可以快速提升人体免疫力，达到 防病毒、抗病毒的目的。研究表明，S A R S-C o V-2在鼻腔 的内皮细胞滴度相对较高，咽喉和支气管细胞逐渐降低，肺部细胞滴度相对较低，这种病毒的感染模式和分布暗示I F N通过滴鼻或喷雾递送到鼻腔或喉咙可能在 局部有效抑制S A R S-C〇V-2病毒的感染27，起到类似疫苗的预防作用。
2020年2 ~5月我国开展了重组人丨F N cxlb预防 C0V ID-19的临床研究[28]。一项是湖北十堰太和医院招募了 2 944名医务人员，低风险组接受重组人IFN- a l b滴鼻预防，高风险组接受重组人I F N-a lb滴鼻联合 胸腺肽注射后，无论在高风险组还是低风险组，28天 C0V ID-19的发病率均为零。作为非严格的对照，同一 时间段全国3 387名医务人员诊断为新冠肺炎患者，其 中3 062名C0V ID-19来自同一地区^在本次研究者发起的开放临床研究中，重组人I F N-a lb滴鼻或联合胸腺肽可以有效增强医务人员对C0V ID-19的防护，暗示 有可能在新冠病毒大流行期间保护老人、儿童等其他高危易感健康人。另一项由中国人民解放军总医院发起、全国12个地区74家医院参与的重组人IFN-a lb 用于医护人员防护的临床研究，研究显示2 0()0余名一 线医护人员应用重组人I F N-a lb喷雾剂每日4〜6次喷鼻，持续14天，观察28天，完成全程随访的1703人医 护人员零感染（未发表数据）。
重组人IFN-a l b肌肉注射用于S A R S-C〇V-2预防的临床试验已获得国家药监局批准：
8展望
1F N是固有免疫中的关键细胞因子，其广谱抗病毒 作用对于人类防治未知病毒意义重大。新冠病毒通过多种机制抑制内源性I型丨F N的表达，以I F N诱导不足 为特征的先天性反应受损是S A K S-C o V-2感染和重症化的重要原因，也是补充外源性I F N进行临床防治的基本依据。各国医生和专家推荐外源性丨型I F N作为 抗C0VID-19大流行的潜在手段[29。屈指可数的1型I F N单用或联合其他小分子抗病毒药物临床研究对C0VID-19大流行的控制已呈良好结果。目前中国 已研制成功S A K S-C o V-2中和抗体，I F N这种广谱抗病毒药物和S A R S-C〇V-2中和抗体靶向药物联合抗病毒效果值得期待。中国重组人IFN-a l b率先开展了预防和C0V1D-I9验证性临床试验，美国、法国、意大利 等国外I F N正在开展C0VID-19的II期临床试验。重组人丨F N-a l l>广谱抗病毒、安全性好，其多种途径如注射、雾化吸人、喷雾和滴眼等在病毒特别是S A R S-C〇V-2等新生病毒出现无药无疫苗可用的情况下，可用 来防止病毒经呼吸道、消化道、皮肤黏膜侵人体内，作 为应急储备抗病毒药物提供全面防护之需[3U;，希望重 组人IFN-a l b严格的随机对照多中心临床试验早日取得良好结果，在目前抗击新冠病毒的斗争以及未来旷日持久的人类与病毒的生存竞争中发挥更大的作用。
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