世界中西医结合杂志2020年第15卷第11期 WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine 2020,Vol 15,No 11
·临床研究·2型糖尿病痰湿热互结证患者肠道
特征分析
于斌1 王敏1,2 李丹2 厉启芳2 张梅2 王乐荣3 刘志华3 魏超1 孙冰1
【摘要】 目的 比较2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)痰湿热互结证患者与健康人的肠道菌
差异,分析糖尿病发病与肠道菌的相关性。方法 招募健康志愿者9例,按照既定的纳入、排除标准,随机筛选
符合痰湿热互结证的T2DM患者16例,之后采集患者的粪便,通过16srRNA技术分析肠道菌Alpha多样性、Beta
多样性及基于门、属种水平的物种组成。结果 T2DM痰湿热互结证患者的菌多样性呈现降低趋势,Alpha多样
性指标ACE稀释曲线和Rank-abundance数据低于健康人,Shannon指数和Simpson指数呈现降低趋势;Beta多
样性指标NMDS法显示个体菌差异较大。与健康人比较,T2DM患者Actinobacteria、Proteobacteria呈现升高趋
势,而Bacteroidetes、Firmicutes呈现降低趋势,其中Proteobacteria和Firmicutes/Bacteroidetes比值比较差异有统计
学意义(P<0.01);属水平Bifidobacterium含量增高,Lactobacillus含量降低(P<0.05),Faecalibacterium、Bacte
roides和Prevotella-9呈现降低趋势;种水平方面,T2DM组Bifidobaterium、Lactobacillus、Bacterium含量高于健康人
(P<0.05,P<0.01),Bacteroides低于健康人(P<0.01)。结论 T2DM痰湿热互结证患者肠道菌的多样
性呈现降低趋势,表现为菌种属等方面的差异,说明证型与肠道菌存在相关性。
【关键词】 糖尿病;宏基因组测序;双歧杆菌;厚壁菌门;拟杆菌
【中图分类号】R587.1    【文献标识码】A
AnalysisthecharacteristicsofIntestinalFloraCharacteristicsonT2DMwithPhlegm
-Dampness-HeatSyndrome
YUBin1,WANGMin1,2,LIDan2,LIQi-fang2,ZHANGMei2,WANGLe-rong3,LIUZhi-hua3,WEIChao1,
SUNBing1
(1.JiningMedicalUniversity,JiningShandong202067;2.TheAffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining
Shandong272029;3.JiningHospitalofTraditionalChineseMedicine,JiningShandong272037)
【Abstract】 Objective Tocomparetheintestinalf
lorabetweenpatientswithtype2diabetesmellitus(T2DM)ac
companiedbyphlegm-dampness-heatsyndromeandhealthypeople,andtoanalyzethecorrelationbetweentheoccur
renceofdiabetesandtheintestinalflora.Methods Ninehealthyvolunteerswererecruited.Additionally,accordingtothe
establishedinclusionandexclusioncriteria,16T2DMpatientswithphlegm-dampness-heatsyndromewererandomlyse
lected.Then,feceswerecollectedfromthepatients,andAlphaandBetadiversityoftheintestinalfloraandspeciescomposi
tionbasedonphylumandspecieslevelswereanalyzedby16srRNAtechnique.Results ThebacterialdiversityinT2DM
patientswithphlegm-dampness-heatsyndromeshowedadecreasingtrend.AlphadiversityindexesACEdilutioncurve
andrank-abundancedatainthepatientswerelowerthanthoseofhealthypeople.ShannonindexandSimpsonindex
showedadecreasingtrendinthepatients.TheBetadiversityindex(NMDSmethod)revealedgreatdifferencesamongindi
vidualfloras.Comparedwiththehealthypeople,ActinobacteriaandProteobacteriaintheT2DMpatientsshowedanupward
8023什么意思代表什么
trend,whileBacteroidetesandFirmicutesshowedadownwardtrend.TheratioofProteobacteriaandFirmicutes/Bacte
roidetespresentedastatisticaldifference(P<0.01).Atthegenuslevel,thelevelofBifidobacteriumincreased,andLacto
bacilluscontentdecreased(P<0.05),Faecalibacterium,BacteroidesandPrevotella-9showedadecreasingtrend;in
termsofspecieslevel,thecontentofBifidobaterium,LactobacillusandBacteriuminT2DMgroupwashigherthanthatin
healthypeople(P<0.05,P<0.01),andBacteroideswaslowerthanthatinhealthypeople(P<0.01).Conclusion The
diversityoftheintestinalflorainT2DMpatientswithphlegm-dampness-heatsyndromeshowsadecreasingtrend.Acor
relationisfoundbetweentheoccurrenceofdiabetesandfloraatthegenusandspecieslevel.
DOI:10.13935/j.cnki.sjzx.201129
基金项目:国家自然科学基金项目(81603509);山东省自然科学基金项目(ZR2016HM65,ZR2014HQ051);
济宁市科技重点研发计划项目(2017SMNS005)
作者单位:1.济宁医学院,山东济宁272067;2.济宁医学院附属医院,山东济宁272029;3.济宁市中医院,
山东济宁272037
刚刚武汉发布最新隔离政策通信作者:孙冰,Email:sdsunb@163.com
世界中西医结合杂志2020年第15卷第11期 WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine 2020,Vol 15,No 11          【Keywords】 DiabetesMellitus;MetagenomicsSequencing;Bifidobacterium;Firmicutes;Bacteroides
  糖尿病根据其病因、遗传学因素和临床表现可以分为1型糖尿病(type1diabetesmellitus,T1DM),2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)、妊娠期糖尿病和其他类型的糖尿病,T2DM因其高发病率和病死率而备受关注,大约占糖尿病患者的90%,我国T2DM的总体发病率是7.9%[1]。T2DM也称为非胰岛素依赖性糖尿病,主要表现为胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗,与遗传因素和多种因素相关。近年来越来越多的研究表明其发病与肠道菌存在相关性,因肠道菌在维持机体健康,食物能量摄取,糖脂代谢等方面具有重要意义[2-3]。
糖尿病可归属于中医学消渴范畴,发病机制与饮食、情志、久坐不动等因素相关,仝小林等[4]认为本病的病机演变按照郁、热、虚、损的阶段进行,病位以脾、胃、肝、肾为主,可分为痰湿热互结证、热盛伤津证、气阴两虚证、肝肾两虚证、阴阳两虚证,虽然本病发病与肠道菌的关系得到越来越多研究的证实,然而对于肠道菌的变化与证型的相关性研究较少,本项目通过分析T2DM痰湿
热互结证患者和健康志愿者的肠道菌数据,有助于进一步阐述证型和肠道菌的相关性。
1 资料与方法
1.1 临床资料
1.1.1 一般资料
选取2018年1月—2018年12月在济宁医学院附属医院门诊就诊的T2DM患者,按照纳入标准和排除标准,共纳入痰湿热互结证患者16例(GroupD)。随机选择正常人中健康志愿者9例(GroupC)。痰湿热互结证患者男8例,女8例,年龄(50.06±13.39)岁,病程(7.88±4.66)年;健康志愿者男4例,女5例,年龄(48.34±6.95)岁,统计数据显示,两组人员在性别,年龄等基本信息方面差异无统计学意义(χ2=0.071,P=0.79),具有可比性。本研究项目通过济宁医学院附属医院伦理委员会批准,所有研究对象均签署患者知情同意书。1.1.2 诊断标准
1.1.2.1 西医诊断标准
参考1999年世界卫生组织WHO公布的糖尿病诊断标准,典型糖尿病症状,随机血糖检测≥11.1mmol/L;或空腹血糖(fastingblood-glucose,FPG)≥7.0mm
ol/L;或葡萄糖负荷后2h血糖≥11.1mmol/L。
1.1.2.2 中医诊断标准
参照《糖尿病中医防治指南》中的标准确定[5],痰湿热互结证主要症状:形体肥胖,腹部胀大,口干口渴,喜冷饮,饮水量多,脘腹胀满,易饥多食,心烦口苦,大便干结,小便黄,舌质淡红,苔黄腻,脉弦滑。1.1.3 纳入标准
(1)符合糖尿病西医诊断标准及中医辨证分型标准;(2)年龄18~65岁;(3)签订知情同意书并积极配合研究工作。
1.1.4 排除标准
(1)严重的肝、肾功能异常、心血管和造血系统疾病者;(2)妊娠期、哺乳期妇女;(3)近1个月合并严重感染者;(4)近1个月内有糖尿病酮症酸中毒等急性并发症者;(5)未签订知情同意书或不配合研究实施者。
1.1.5 菌样本收集及检测
吃吃的爱票房粪便采集后立即进行液氮冻存,之后通过干冰运输至成都贝斯拜尔生物科技有限公司进行16srR
NA测序分析。数据的分析主要包括优质序列的提取,OTU的聚类和注释,基于OTU聚类和注释的分析结果的稀释曲线绘制和多样性指数分析,落结构的统计分析和物种丰度差异分析。
1.2 统计学方法
数据使用SPSS19.0统计分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示;菌每组门、属、种不同指标多个样本的占比分析采用每个物种在各个样本中的表达量/该物种序列总和进行描述分析;组间菌门水平及种水平差异比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 菌多样性分析
2.1.1 Alpha多样性分析
稀释曲线(Rarefactioncurve)是从每个样本中随机抽取一定数量的序列,统计这些序列所代表的OTU数目,以随机抽取的序列数与OTU数来构建的曲线。它可以用来比较不同样本中的物种多样性情况,也可以用来说明样本的测序数据量是否足以反映环境中的物种多样性。
Ace指数是用来估计落中含有OTU数目的指数,是生态学中估计物种总数的常用指数之一,默认
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将序列量10以下的OTU都计算在内,从而估计落
中实际存在的物种数。ACE指数越大,表明落的丰
富度越高。本研究ACE稀释曲线图显示,T2DM患者
的菌落多样性低于健康人。结果见图1。
图1 依据OTU总数绘制的样本ACE指数图
Rank-abundance曲线也是分析样本中微生物
多样性的一种方法,水平方向上,各样本曲线宽度
反应微生物物种的丰富度,曲线在横轴上的范围越
大,体现出不同样本的物种存在较大的物种多样性
差异,图片结果数据与ACE数据一致,说明T2DM
患者菌丰富度低于健康人。结果见图2。
世界中西医结合杂志2020年第15卷第11期 WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine 2020,Vol 15,No 11        主要菌门是Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacte ria、Proteobacteria、Fusobacteria,占比分别为59.09%、34.70%、3.33%、2.38%、0.04%。不同菌门占比数据显示,与健康人相比,T2DM患者Actinobacte ria、Proteobacteria呈现升高趋势,而Bacteroidetes、Firmicutes呈现降低趋势,其中Proteobacteria和Fir micutes/Bacteroidetes比值差异有统计学意义(P<0.01)。结果见图5和图6。
图5 两组样本菌门水平的比例分布
2.2.2 属水平的菌构成分析
两组样本共检测到213个菌属,痰湿热互结证患者的主要菌属是Bacteroides(拟杆菌属)、Prevotel la-9(普雷沃氏菌属9)、Bifidobacterium(双歧杆菌属),Parabacteroides(副杆状菌属)、Lactobacillus(乳杆菌属)、Blautia(布劳特氏菌属),Faecalibacterium(柔嫩梭菌属),占
比分别为23.9%,11.05%,8.73%,4.17%,3.64%,3.61%,2.92%,健康人主要的菌属是Prevotella_9、Faecalibacterium、Bacte roides、Lachnoclostridium、Bifidobacterium、Phascolarc tobacterium(考拉杆菌属)、Ruminococcus(瘤胃球菌属),分别占比为19.77%、13.87%、13.36%、3.28%、2.74%、3.65%、3.65%、2.23%。两组人菌菌
属分布见图7
。  注:C1~c16为GroupD;n1~n9为GroupC
图7 两组样本菌属水平分布图
数据结果还显示,与健康人菌属相比,糖尿病组患者的Bifidobacterium显著增高,而Lactobacil lus显著降低(P<0.05)。结果见图8。2.2.3 种水平的菌构成分析
数据结果显示,痰湿热互结证患者在种水平的构成主要是Bifidobacterium_longum、Bacteroides_fra gilis_str._3998T[B]、Bacte
徐少华 朱琳rium_BM0331、Bacteroides_coprocola_DSM_17136、Bifidobacterium_kashiwano hense、Human_gut_metagenome,合计占比为21.64%;健康人种水平的构成主要是Bifidobacterium_kashiwanohense、Ruminococcus_gnavus_CC55_001C、Bifidobacterium_longum、Bacteroides_coprocola_DSM_17136、Megamonas_funiformis、Bacterium_BM0331,占比总计为6.25%。对Bifidobaterium种的数据进行统计分析,结果显示,种水平方面,T2DM组Bifidobaterium、Lactobacillus、Bacterium含量高于健康人(P<0.05,P<0.01),Bacteroides低于健康人(P<0.01)。结果见图9。
中秋节几月几号  注:与GroupC比较,a
P<0.01
图6 两组人门水平数据分析
        世界中西医结合杂志2020年第15卷第11期 WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine 2020,Vol 1
5,No 11
王母娘娘和玉皇大帝什么关系
  注:与GroupC比较,aP<0.05
图8 两组样本属水平的差异分析
  注:与GroupC比较,aP<0.05,b
P<0.01
图9 两组样本种水平的差异分析
3 讨 论
糖尿病是多种代谢途径功能异常导致的内分泌系统疾病,最新数据显示全球范围内大约现有
4.25亿患者,预测2045年数量可达到7亿[6]
。我国
的患病人数在1.14亿,占全球糖尿病患者的1/
3[7]
。T2DM属于代谢性疾病的一种,特征是胰岛素
分泌绝对或相对不足,靶器官对胰岛素的敏感性降低,还表现为脂肪、蛋白质、水、电解质和其他代谢功能的紊乱。发病机制除了与基因、环境、饮食等
因素相关外,现今研究认为肠道菌在T
2DM的发病发展过程中具有相当程度的影响[8]
肠道菌在维持机体动态平衡和免疫调节方面具有重要作用,其异常是多种感染及非传染性疾病的重要发病因素,现有研究表明肥胖、糖尿病、代谢性疾病、炎症性肠病等都与肠道菌的异常存在
相关性[9]。人体肠道约含有1014左右的细菌,种类
有500~1000余种,是人体细胞的10倍,主要集中
在大肠内,是人体DNA数量的150~500倍[10],因而肠道菌被认为是人体的第四大消化系统[11]
。研究发现[12]
过多摄入的食盐、糖类、脂类等会影响
到肠道菌的平衡,导致有益微生物减少,而条件性致病微生物增多,致使肠道存在慢性低度炎性反
应,促使胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)和
T2DM的发生。
有学者[13]
对345个糖尿病患者和健康人的
肠道菌进行分析,发现了大约6万个与糖尿病相
关的分子标记物,另有研究显示[14-16]
,糖尿病患者
Bifidobacteria、Clostridium、Firmicutes明显低于健康人,而Bacteroides和β-proteus明显升高,并且
Bacteroides/Firmicutes、Firmicutes/Clostridium的比值与血糖存在正相关。本研究发现,T2DM患者Ac tinobacteria、Proteobacteria呈现升高趋势,而Bacte roidetes
、Firmicutes呈现降低趋势,与L?K等其他学者的相关研究的结果一致[17-18],L?K等发现糖尿病患者存在Firmicutes和Clostridia含量的降低[17]。
另有研究发现,在T
2DM患者中也存在Proteobacte