Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ mｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ
任桥梁房间吓人 ＨＡＮ Ｙａ－ｎａｎ，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－ｊｕａｎ，ＬＩ Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＣＡＩ Ｌｕ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ）什么型的B最好带图
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＳＤＳ， ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ｌｏｗ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏ
ｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｗａｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ； ｔｈｕｓ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．
平安夜祝福语短句 Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
计算机的应用 蒙古黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）属双子叶植物纲豆科植物，分布于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西等地，可以补气固表、托毒生肌、利水退肿。治气短心悸、乏力、虚脱、自汗、盗汗、体虚浮肿、慢性肾炎、久泻等疾病［１］。近年来由于环境的恶化、土地盐碱化愈加严重，蒙古黄芪资源逐渐匮乏。因此，高盐环境下蒙古黄芪的生理生化特性及分子生物学研究就变得尤为重要，而进行这些研究的必要前提就是提取高质量的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ。提取植物基因组ＤＮＡ的方法有很多，其中
高盐提取基因组ＤＮＡ方法的优点是可以将ＤＮＡ与蛋白质、多糖充分分离，对提取含有大量次生代谢产物物种的ＤＮＡ是较为理想的方法［2］。据此，本实验选用了３种高盐方法，即高盐ＳＤＳ法［３］、高盐ＣＴＡＢ法［４］和高盐低ｐＨ值法［５］，比较３种方法的提取效果，以到黄芪基因组ＤＮＡ的最佳提取方法，为进一步分子生物学研究奠定基础。
宫锁珠帘演员表图片 １材料与方法
１．１材料
本实验采用种植了两周的蒙古黄芪叶片作为研究对象，蒙古黄芪种子购于内蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家营子镇中药材基地。
１．２仪器
水浴恒温摇床（ＺＨＷＹ－１１０Ｘ３０），台式多功能高速离心机（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ），紫外分光光度计（ＮＤ－１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ），凝胶成像仪（ＧｅｎＧｅｎｉｕｓ），基因扩增仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ１）。
１．３无菌苗的种植
１．３．１种子预处理挑选饱满的黄芪种子，用研钵研成粉末，研磨过程中加入少许沙粒，用７５％的乙醇浸泡３０ ｓ，０．１％浸泡５ ｍｉｎ，无菌水冲洗３次，最后用无菌水３７℃浸泡３ ｈ［６］。
１．３．２培养基母液配制大量元素１ ０００ ｍＬ，含硝酸钾１９．０ ｇ、 氯化铵２２．２ ｇ、 ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ３．７ ｇ、磷酸二氢钾１．７ ｇ、 无水ＣａＣｌ２ ３．３ ｇ。有机成分２００ ｍＬ，含肌醇２．０ ｇ、 盐酸硫胺（ＶＢ１）０．００２ ｇ、 盐酸吡哆
锌（ＶＢ６）０．０１ ｇ、 烟酸０．０１ ｇ、 甘氨酸０．０４ ｇ。螯合铁２００ ｍＬ， 含ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．１１ ｇ、 乙二胺四乙酸
二钠１．５ ｇ。微量元素２００ ｍＬ，含ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ
３．４ ｇ、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．７ ｇ、Ｈ３ＢＯ４ １．２ ｇ、ＫＩ ０．１７ ｇ、
Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ０．０５ ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ、ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ。
１．３．３分装培养基取１００ ｍＬ三角瓶，加入２０ ｍＬ ＭＳ培养基（大量元素１００ ｍＬ／Ｌ，微量元素１０ ｍＬ／Ｌ，有机成分１０ ｍＬ／Ｌ，螯合铁１０ ｍＬ／Ｌ，蔗糖３０ ｇ／Ｌ，琼脂７．０ ｇ，调ｐＨ值为５．７，１２１℃，２０ ｍｉｎ高压灭菌）。每个三角瓶接种５～６颗种子，人工气候箱光照和暗培育各１２ ｈ交替进行，温度设置为（２０±１）℃，湿度为７０％，待发芽后，取长出的叶片作为提取ＤＮＡ的材料。
１．４黄芪基因组ＤＮＡ的提取方法
１．４．１高盐ＳＤＳ法［３］取黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４ ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成粉末，将粉末转入离心管中，立即加入８０ μＬ溶液Ⅰ
笔记本电脑驱动 （５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔris－HＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）和１６ μＬ β－巯基乙醇，置于室温数分钟至解冻；加入２７０ μＬ １０％
ＳＤＳ，轻轻混匀；６５℃水浴２５ ｍｉｎ；将离心管取出后立即置于冰上，并加入１２０ μＬ ５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ反应３５ ｍｉｎ。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２０ ｍｉｎ；取上清液，加入０．９倍体积的异丙醇，轻轻混匀后，－２０℃过夜放置。４℃，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心２０ ｍｉｎ；弃上清液，用５００ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解沉淀；向其中加等体积的氯仿－异戊醇（２４∶１，Ｖ／Ｖ，下同）溶液混匀后，４℃，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ；取上清液，向其中加入０．８倍体积的异丙醇和０．１倍体积的
３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液，于－２０℃放置１ ｈ后，４℃，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ；弃上清液，用１ ｍＬ ７０％乙醇漂洗，４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ，弃上清，干燥
３ ｈ；加５０ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解沉淀；加４ μＬ １０ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ混匀，并在３７℃环境下温浴３０ ｍｉｎ，置于－２０℃下备用。
１．４．２高盐ＣＴＡＢ法［４］①提取缓冲液配方。ＤＮＡ提取缓冲液Ⅰ为０．３５ ｍｏｌ／Ｌ Ｓｏｒｂｉｔｏｌ（山梨醇）、
１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值为７．５）、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，核裂解缓冲液Ⅱ为１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值为７．５）、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２％ ＣＴＡＢ，５％十二烷基肌氨酸钠Ⅲ，以上３种溶液配制后进行高压灭菌（１２１℃，１５ ｍｉｎ）。使用前，在核裂解缓冲液Ⅱ中加入ＤＮＡ提取缓冲液总体积１％的ＰＶＰ，ＰＶＰ完全溶解后，将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液按１．０∶１．０∶０．４的体积比混合，用前把提取混合液预热到６０～６５℃。②提取步骤。取蒙古黄芪幼苗的新鲜叶片０．２～０．４ ｇ于研钵中，快速加入液氮并将其研成粉末，将粉末转入离心管中；加入等体积预热的ＤＮＡ提取混合液 （４００～６００ μＬ），立即混匀，置于６５℃恒温水浴摇床上，４０～５０ ｒ／ｍｉｎ摇匀 ９０ ｍｉｎ；冷却到室温，加入等体积的氯仿－异戊醇（２４∶ｌ），轻轻上下颠倒１０～１５ ｍｉｎ，常温条件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；立即转移上清液到新的２ ｍＬ离心管中，加入总体积２／３的预冷异丙醇，上下颠倒５ ｍｉｎ，在－１０～４℃下静置３０ ｍｉｎ后，常温条件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发干净，加入６００ μＬ ７５％乙醇，在４℃漂洗过夜；然后在常温条件，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃乙醇，将ＤＮＡ风干（不可太干燥），加入５００ μＬ
１×ＴＥ缓冲液，置６５℃水浴１０ ｍｉｎ，常温条件下使ＤＮＡ完全溶解；加入1 μＬ １０ ｍｇ／ｍＬ ＲＮＡ酶，３７℃温育３０ ｍｉｎ；冷却到室温，加入等体积的氯仿－异戊醇（２４∶1），轻轻上下颠倒１０～１５ ｍｉｎ，常温条件下５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；立即转移上清至新的２ ｍＬ离心管中，加上清的２／３体积的预冷异丙醇，再加入上清的０．１倍体积的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ，混匀，－１０～４℃静置 ３０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ；轻轻倒掉上清，使异丙醇挥发干净，加入６００ μＬ ７５％乙醇，４℃漂洗过夜，弃乙醇，干燥３ ｈ，加５０ μＬ 1×ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ；置于－２０℃备用。
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