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板栗（Castanea mollissima Bl .），是壳斗科（Fagaceae ）栗属（Castanea ）坚果类植物[1]，生长于海拔370～2800m 的区域，广泛分布在越南、中国等国家，现主要以人工栽培为主[2]。板栗营养丰富，含有大量淀粉、蛋白质、脂肪、B 族维生素等多种营养素，被称为“干果之王[3]。板栗中蛋白质含有18氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量较高，有8种人体必需氨基酸，它们的含量占氨基酸总含量的33.59%[4]。
食品中蛋白质的测定方法有两类：直接法和间接法[5]。杜马斯燃烧法和凯氏定氮法是使用最广泛的间接法[6-7]，而近红外光谱法、紫外分光光度法、电泳法、紫外吸收光谱法和Bradford 法是常见的直接法[5]。凯氏定氮法因灵敏度高、稳定性好、成本低廉，是目前进行氮含量测定常见的方法，也是国内外法定的检测方法[8]。目前，大量文献报道了凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量，但针对特定食品蛋白质的研究仅限于大豆、小麦、乳制品和大米[9-15]。食品基质复杂，普适性方法需要根据实际情况进行适当调整和改进，有必要针对性地建立核桃蛋白质检测方法，在最短的时间内得到更精准的结果。本实验参照《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中的凯氏定氮法测定板栗种仁中粗蛋白含量[16]
，
通过方法优化，得到精准的含量值，为板栗种仁粗蛋
白快速、准确测定提供了科学参考。
方法原理：蛋白质是含氮的有机化合物。板栗果实中的粗蛋白与硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即
为蛋白质含量；其反应式如下：
2NH 2（CH 2）2COOH+13H 2SO 4→（NH ）2SO 4＋6CO 2＋12SO 2＋16H 2O
（1）（NH 4）2SO 4+2NaOH →2NH 3+Na 2SO 4+2H 2O （2）2NH 3+4H 3BO 3→（NH 4）2B 3O 7+5H 2O （3）（NH 4）2B 4O 7+2HCl+5H 2O →2NH 4Cl+4H 3BO 3
（4）
1试剂和材料
1.1试剂
本实验方法所用试剂均为分析纯，水为三级水。试剂包括五水硫酸铜（CuSO 4·5H 2O ）、硫酸钾（K 2SO 4）、硫酸（H 2SO 4）、硼酸（H 3BO 3）、甲基红指示剂（C 15H 15N 3O 2）、溴甲酚绿指示剂（C 21H 14Br 4O 5S ）、氢氧化钠（NaOH ）、95%乙醇（C 2H 5OH ）、盐酸（HCl ）、无水碳酸钠（Na 2CO 3）基准试剂、硫酸铵（（NH 4）2SO 4
）标准品。1.2试剂配制
（1）硼酸溶液（20g/L ）：称取20g 硼酸，加水溶解后，稀释至1000mL 。
（2）氢氧化钠溶液（30%）：称取300g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1000mL 。
（3）盐酸标准滴定溶液［C （HCl ）］0.1moL/L ：量取9mL 分析纯浓盐酸（HCl ）于1000mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀；称取于270～300℃高温炉中灼烧至恒量的工作基准试剂无水碳酸钠0.2g （精确到0.0001g ）溶于50mL 水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制的盐酸溶液滴定至溶液由绿变为暗红，煮沸2min ，加盖具钠石灰管的
【基金项目】广西创新驱动发展专项资金项目（项目编号：桂科AA17204058-21）。
【作者简介】谷瑶，女，湖南湘潭人，广西壮族自治区林业科学研究院高级工程师，从事林产化工和香精香料研发工作：曾永明（通信作者），男，广西桂平人，广西壮族自治区林业科学研究院高级工
程师，从事林化产品的研究和分析检测工作。
全自动凯氏定氮仪在板栗粗蛋白含量测定中的应用
谷瑶，周丽珠，栾洁，杨漓，曾永明，蒙芳慧（广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁530002）
【摘要】文章建立一种用全自动凯氏定氮仪测定板栗中粗蛋白含量的方法，通过板栗与
硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为粗蛋白含量。结果表明：采用全自动凯氏定氮仪测定（NH 4）2SO 4标准品氮回收率为99.8%～99.9%，测定板栗粗蛋白含量平均为4.1894%，相对标准偏差为0.28%（＜10%）（n ＝6）。说明该方法具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，相对偏差小，是板栗种仁中粗蛋白测定的首选方法。【关键词】板栗；粗蛋白；凯氏定氮法；消解；蒸馏【中图分类号】S7
【文献标识码】A
【文章编号】1674-0688（2020）12-0081-03
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橡胶塞，冷却，继续滴定至溶液再呈暗红；同时做空白试验，准确计算盐酸标准滴定溶液浓度［C（HCl）］。
（4）甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。
（5）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。三吉彩花八卦
（6）混合指示液：1份甲基红乙醇溶液与3份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
（7）吸收液：硼酸溶液（20g/L）和混合指示液均匀混合而成。
1.3仪器和设备
ME204/02型分析天平［感量为1mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产］，K12A全自动凯氏定氮仪（上海晟声自动化分析仪器有限公司生产），SH230N石墨炉消解仪（山东海能科学仪器有限公司生产），DFT-200C超高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司生产），101-2ES电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司生产）。
2实验步骤
2.1采收
本实验的板栗果实采自广西百市隆林县，采收方法有两种，即拾栗法和打粟法。拾栗法就是待栗充分成热，自然落地后，人工拾栗实。打栗法就是分散分批地将成熟的栗苞用竹竿轻轻打落，然后将栗苞、栗实拣拾干净。
2.2制样
板栗进行暴晒后去壳，在110℃电热鼓风干燥箱内干燥1～2h，用超高速粉碎机粉碎，装入塑料瓶中备用。
2.3消解
消解药品：浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜。板栗消解条件：称取板栗样品0.5g（精确至0.0001g）于干燥消解管内，依次加入3.5g硫酸钾、0.5g硫酸铜、10mL浓硫酸，消解过程采用曲线升温模式，设定消解炉消解参数：一阶段220℃维持20min，二阶段420℃维持60min（消解炉可提前预热至220℃），放入样品，打开尾气回收，待时间结束，可观察样品，与试剂空白一样呈澄清，有淡绿即为消解完全，静置冷却。
2.4蒸馏
检查并补充蒸馏水桶、碱液桶、硼酸桶、标液瓶内试剂；打开电源开关，同时打开自来水阀；在“维护”栏“初始化滴定器”1次，“清洗滴定缸”3次；开机时，手动先排空酸、
碱管气体（点击“维护”再点击“酸泵”“碱泵”），并置换标液（点击“初始化滴定器”3次），点击“清洗滴定缸”3次；点击“参数设置”输入“标液浓度”“换算系数”数值；安装一空消化管，关闭安全门，点击“测试”，点击“工作模式”选择“空白测试”，设置碱液量为10mL，吸收液量为30 mL，点击“运行”空蒸，当连续两次空白值相差不大于0.1 mL，取后一次空白值为仪器空白（消解样空白此时可测），然后把空白值输入“维护”中“参数设置”输入“空白”数据；测定前应该先用（NH4）2SO4标准品做氮回收率的测定，借以验证所用仪器、试剂及操作等条件的可靠性；要求（NH4）2SO4标准品氮回收率在95%~105%；点击“测试”依次输入“样品量”“吸收液量”（30mL）“碱液量（60mL）”，然后安装样品，点击“运行”。工作完成后，点击“数据”寻对应的样品编号，点击编号调出测试结果，并记录；全部测试结束，点击“维护”“清洗滴定缸”，关闭电源、水源。
2.5数据处理
板栗样品中蛋白质的含量按下面的公式计算：
X=（V1-V2）×C×0.0140
m×V3/100×F×100
上式中：X为试样中蛋白质的含量，单位为g/100g；V1为试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL；V2为试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL；C 为硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为mol/L；0.0140为盐酸［C（HCl）=1.000mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g；m为试样的质量，单位为g；V3为吸取消化液的体积，单位为mL；F为氮换算为蛋白质的系数，板栗中氮转换系数为5.30；100为换算系数。
3结果与讨论
以K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗种仁中粗蛋白含量，其中蒸馏（NH44）2SO4标准品的氮回收率见表1，板栗样品中的蛋白质含量见表2。板栗果实中粗蛋白质含量平均为4.189
序号样品质量（g）滴定量(mL)氮含量(%)氮回收率（%）
10.104254.387221.1899.9
20.105154.805221.1699.8
30.105655.143621.1999.9
表1蒸馏（NH4）2SO4标准品的氮回收率
注：盐酸标准溶液浓度C（HCl）=0.02898mol/L，空白滴定量＝0.01mL。
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4%，该板栗样品测定的粗蛋白符合《GH/T 1029—2002板栗》中蛋白质理化要求≥3.4%的要求。本实验采用K12A 全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中粗蛋白质的含量具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，测定板栗果实中粗蛋白质含量的相对标准偏差为0.28%（<10%，n =6），相对偏差小，是板栗果实中粗蛋白质含量测定的首选方法。
使用K12A 全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中的粗蛋白质所得结果误差符合《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）标准要求的两个测定值的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4结语
本文采用全自动凯氏定氮法测定广西百地区板栗种仁的粗蛋白，测定板栗粗蛋白含量平均为4.1894%，相对标准偏差为0.28%（<10%，n =6）。全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质，具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，相对偏差小，是板栗种仁中粗蛋白测定的首选方法。
参考文献
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测定［S ］．
序号
样品质量
（g ）滴定量(mL)氮含量(%)蛋白含量(g /100g)蛋白含量平均值(g /100g)
RSD (%)
1
谢贤打曾江0.5677
9.3551
0.6523
4.1770
4.1894
0.28
20.57239.43650.6640 4.1797
沂怎么读拼音30.54379.02980.6736 4.2097
40.53918.91740.6708 4.1927
50.56289.30940.6701 4.1882
60.55969.25650.6702 4.1888
表2
板栗样品中的蛋白质含量
注：盐酸标准溶液浓度C （HCl ）=0.02898mol/L ，空白滴定量＝0.01mL 。
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