作者单位:100730北京，中国医学科学院北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室
*
通信作者：夏维波，E-
烛光晚餐菜谱
mail :xiaweibo@medmail．com．cn DOI :10.3969/j．issn．1674-2591.2012.01.002
·临床研究·
迟发性脊柱骨骺发育不良的临床诊断及SEDL 基因突变分析
孙静，夏维波*
，李梅，姜艳，王鸥，聂敏，赵真，邢小平，周学瀛，孟迅吾，胡莹莹，刘怀成
［摘要］目的分析1个迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT )家系的临床特征，检测其致病基因SEDL
的突变类型。方法1个3代累及4例患者的中国人SEDT 家系纳入本研究。根据临床表现、骨骼影像学及实验室检查诊断先证者及患者为SEDT ，采用PCR 及直接测序法进行SEDL 基因突变检测。结果
2019个人所得税税率表该家系的所有
4名受累者均为男性，表现为颈短、短躯干型个矮、遗传方式符合X 染体连锁隐性遗传。SEDL 基因分析表明在男性受累患者中第4外显子存在c.127_135delCATGCTGCT 半合子突变，而女性携带者基因型为杂合子。结论
在中国人SEDT 家系中发现了SEDL 上的新缺失突变c.127_135delCATGCTGCT 。
［关键词］
迟发性脊柱骨骺发育不良;SEDL 基因;TRAPPC2基因；突变
中图分类号:R 596文献标识码:A
Clinical diagnosis and SEDL gene mutation analysis for spondyloepiphyseal dysplasia tarda SUN Jing ，XIA Wei-bo *，LI Mei ，JIANG Yan ，WANG Ou ，NIE Min ，ZHANG Zhen ，XING Xiao-ping ，
ZHOU Xue-ying ，MENG Xu-wu ，HU Ying-ying ，LIU Huai-cheng
Department of Endocrinology ，Peking Union Medical College Hospital ;Key Laboratory of Endocrinology ，Ministry of Health ，
Chinese Academy of Medical Sciences ，Beijing 100730，China天才童声左溢
［Abstract ］
Objective
To analyse the clinical features of patients with SEDT in a Chinese family and to investi-gate the mutation of SEDL gene for SEDT．Methods
We studied a three-generation Chinese SEDT kindred with four af-
fected males．SEDT was diagnosed on the basis of the clinical manifestations ，imaging characteristics of bones and labora-tory evaluation．Mutation analysis of SEDL was performed by polymerase chain reaction (PCR )and by direct DNA se-quencing．Results
Four affected individuals in this family were diagnosed as SEDT by short trunk dwarfism ，characteris-tic vertebral malformations and the X-linked recessive inherited pattern．A novel 9-base pair deletion in exon4of SEDL gene was identified which was c.127_135delCATGCTGCT．All affected males were hemizygotes and female carriers were heterzygotes．Conclusion
A novel mutation c.127－135delCATGCTGCT in exon 4of SEDL gene was identified in this
Chinese pedigree with SEDT．
［Key words ］
spondyloepiphyseal dysplasia tarda ;SEDL ;TRAPPC2;mutation
脊柱骨骺发育不良(SED )是一大类遗传异质性骨病，根据不同类型其致病基因各异，遗传方式包括常染体显性、隐性及X 染体连锁隐性遗传。该病的共同特征是累及椎体及骨骺，临床主要表现为个矮及关节退行性变，影像学表现为椎体变
扁及骨骺发育不良。根据《国际遗传性骨病分类
标准(2010年版)》［1］
，SED 按其分子遗传、临床
表现以及影像学特点分为先天性脊柱骨骺发育不良(SEDC )、迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT )及其他一些更罕见的类型，如SEDT 伴进行性骨关节
·
7·CHIN J OSTEOPOROSIS ＆BONE MINER RES Vol．5No．1March 20，2012
病，Kimberley型、Wolcott-Rallison型等。
迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT，MIM 313400)是X染体连锁隐性遗传病，发病率大约是2:1000000［2］，通常儿童时期起病，以不成比例的短躯干型个矮及胸腰椎椎体扁平为特征，伴有关节退行性变。SEDT致病基因SEDL位于X染体短臂2区2带(Xp22)［3］，编码含140个氨基酸的蛋白质sedlin，又名转运蛋白颗粒复合物2 (transport protein particle complex2，TRAPPC2)，参与在内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合。SEDL突变导致软骨细胞蛋白运输出现障碍，使Ⅱ型胶原等无法分泌形成正常的细胞外基质结构。本文报道1个SEDT家系患者的临床表现、X 线特点及SEDL基因突变类型。
对象与方法
研究对象
患者1(Ⅲ5)，先证者，男性，12岁，因身材矮小6年就诊。患者为第1胎，足月顺产，出生体重2.7kg，身长49cm。母乳喂养至10个月。4个月出牙，1岁3个月会走。6岁时父母发现其身高矮于正常同龄男孩。现身高135cm，小于同年龄同性别第3百分位，体重35kg，指距139cm。颈短，短躯干，脊柱轻
度侧弯，胸廓前突，呈桶状，腿直，步态稳，无关节疼痛及活动受限。无智力障碍。阴毛Ⅰ期，11岁10个月变声，一直无明显生长加速。实验室检查血钙、血磷、碱性磷酸酶正常。24h尿钙排泄正常。生长激素(GH)激发试验GH峰值＞40ng/mL。甲状腺功能正常。影像学检查示胸、腰椎体前后径增宽，椎体前部变扁，椎间隙尚可。头颅及腕关节X线未见异常。
患者2(Ⅱ5)，先证者大舅，47岁，终身高155cm，出生情况无异常。上小学时身高矮于同班同龄男孩。颈短，短躯干，无关节疼痛及活动受限。
家系其他患者情况：先证者二舅(Ⅱ7)，终身高140cm，先证者姨表兄(Ⅲ2)21岁，短躯干(具体身高不详)。家系其他成员情况：先证者父亲(Ⅱ10)身高175cm，母亲(Ⅱ9)身高155cm，外祖父(Ⅰ1)身高172cm，外祖母(Ⅰ2)身高153cm(图1)
。
图1SEDT患者家系图谱
Fig1Pedigree of SEDT patients
血样采集
所有受试者均签署知情同意书，采集患者1 (Ⅲ5)，患者2(Ⅱ5)及患者1父母(Ⅱ9和Ⅱ10)的外周静脉血各2mL EDTA抗凝冻存备基因分析。
李健经纪人>柳岩整容前的照片DNA提取及PCR扩增及突变检测
EDTA抗凝血200μL，按照Qiangen试剂盒操作流程提取全基因组DNA，UV1700紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。Oligo6设计引物(表1)，扩增SEDL基因的4个编码外显子、外显子内含子交界区及5'和3'侧翼序列，PCR反应体系40μL，Taq mix20μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，基因组DNA1μg，加水至40μL。反应条件：预变性95℃5min，变性94℃30s，退火30s，延伸72℃30～45s，末次延伸72℃10min，扩增产物送专业测序公司切胶纯化并双向测序。测
表1引物序列
Table1Sequence of primers
十字军之王3引物位置序列
片段长度bp/
退火温度℃SEDL-2F外显子25'-TCCCTGGAGGACTTCGTAGCC3-'671/ SEDL-2R5-'GCTCACCACCCGAATCCTA3-'57.2 SEDL-3F外显子35'-AGCCCAGCTTACTCTACCAG3-'745/ SEDL-3R5'-GCGGCAATCCACTACAG3-'51.5 SEDL-4F外显子45'-AGTTTCCTCCCAGACCTTGA3-'675/ SEDL-4R5'-CAGAGCCTGGCATCTATGTT3-'51.5 SEDL-5F外显子55'-CTCTCGACCTCGTAGATGA3-'779/ SEDL-5R5'-GGAGTTGCCAGAGATAGTTC3-'51.5 SEDL-6F外显子65'-CAGAAACTTAAGATTTGTCAGC3-'326/ SEDL-6R5'-TGACATGAGACAGAATGTACTA3-'51.5
序结果与参考序列NG_011555．1及mRNA 不同的剪切版本NM _001011658.3，NM _001128835.2，NM_014563.5比对确定SEDL 突变。
结果
对2例患者及其家属SEDL 基因全部外显子进行测序并与正常SEDL 序列比对发现，患者1(Ⅲ5)和患者
2(Ⅱ5)均存在第4外显子9个核苷酸CATGCTGCT 的缺失，造成编码氨基酸组氨酸-丙氨酸-丙氨酸序列缺失。与NM_001011658.3，NM_014563.5比对，缺失序列位于cDNA 的第127位至135位。与NM_001128835.2比对，缺失序列位于cDNA 的第229位到第237位，造成相对应位置编码氨基酸序列缺失(图2)。2例患者均为半合子，先证者的母亲(Ⅱ9)为杂合子，先证者的父亲(Ⅱ10)该基因测序结果正常。
讨论
本研究对象系1个包含3代人4例患者的SEDT 家系，患者均为男性，符合X 染体连锁隐性遗传特征。SEDT 临床特征为童年时期起病，通
常在3～12岁［4］
，表现为颈短，短躯干型个矮，四
肢关节退行性变，桶状胸，特征X 线表现胸、腰椎体前后径增宽，前缘变扁，呈倒置的奶瓶状。根据先证者的临床表现、影像学检查及家系遗传方式，初步诊断为SEDT 。应用PCR 扩增、DNA 直接测序法，对先证者及其大舅、先证者的父母进行了基因突变检测证实，该家系患者存在SEDL 基因的缺失突变c.127_135delCATGCTGCT ，为半合子，其母亲为携带者，从分子生物学水平确定了SEDT
的诊断。经检索HGMD 数据库及PubMed 确定该缺失突变为SEDL 基因的新变异类型
。
图2SEDT 患者家系SEDL 测序结果
Fig 2
Genetic analysis of SEDL in this SEDT family
A ：患者突变(半合子);
B ：正常序列;
C ：女性携带者突变(杂合子);
D 、
E 、
F 分别是A 、B 、C 图的反向测序结果
·
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SEDL的mRNA有3个不同的剪切版本。版本1 (NM_001011658.3)含有6个外显子，第3至第6外显子为编码外显子，翻译起始密码位于第3外显子，翻译产物为sedlin异构体1，含有140个氨基酸，是sedlin的主要活性部分。版本3(NM_ 014563.5)较版本1缺少第2外显子，但由于缺失的第2外显子并不参与编码氨基酸，版本3的翻译产物亦为sedlin异构体1。版本2(NM_ 001128835.2)，翻译起始密码位于第2外显子，翻译产物为sedlin异构体2，在氨基端比异构体1多34个氨基酸。3个mRNA版本仅在第2、3外显子的编码区有差异，第4、5、6号外显子及其编码区相同。该家系突变位于第4外显子，c.DNA第127至135位，CATGCTGCT缺失，造成原氨基酸序列第43位至45位组氨酸-丙氨酸-丙氨酸缺失。患者具有该缺失突变导致较为典型的SEDT临床表现，推测该3个氨基酸序列对蛋白功能至关重要，其缺失会影响sedlin蛋白参与在内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合功能，从而导致椎体发育异常。
已经报道的SEDL突变共46个(数据来自HG-MD Professional)，主要集中在第4、5、6外显子及内含子区域，错义突变相对较少，大多数突变都是插入/缺失突变、无义突变及剪切突变。值得一提的是，SEDL基因突变方式中剪切位点突变较为常见，尤其是第4内含子有多种不同的剪切方式。经典剪切位点为gt-ag，但是第4内含子存在非经典的at-ac剪切位点，该区域可能存在不同于经典剪切方式的其他机制，造成剪切区临近区域包括外显子的突变都可能产生新的剪切方式或激活隐藏的剪切位点。Xiong和Guo等［5－6］在中国1个SEDT家系中发现，内含子4的供体位点发生突变ⅣS4+1A＞G可导致7种异常转录本产生。其他位于外显子-内含子交界区域的突变IVS4+4T＞G［7］，IVS4-9-12del，I
VS4-9-11del，IVS5-4-10delTCTTTCCinsAA［8］，亦导致新的剪切方式产生及隐藏的剪切位点的暴露，因此剪切位点突变在SEDL的分子发病机制中有突出的地位。
SEDL编码蛋白sedlin的功能尚未研究清楚，其整体为一个结构域，参与形成转运蛋白颗粒(transport protein particle)，发挥在内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合的功能［9］。Choi等［10］对S73L，F83S和V130D3个错义突变的功能进行研究，结果显示这3个错义突变均引起蛋白折叠异常导致蛋白三级结构的破坏，造成突变蛋白极易被蛋白酶降解而不能发挥生物学作用。作者对所发现的c.127_135delCATGCTGCT突变体蛋白进行结构预测的结果表明，第43～45位组氨酸-丙氨酸-丙氨酸序列位于蛋白氨基端第1个ɑ螺旋结构内部，其缺失导致其所在的ɑ螺旋结构较野生型松散并引起空间构象变化，这一变化导致蛋白失活可能是造成携带该突变家系的发病机制［11］(图3)。sedlin 蛋白晶体结构研究结果显示其三级结构表面多个疏水氨基酸残基，形成一个非极性疏水袋和疏水槽
，
图3野生型及突变型sedlin蛋白结构预测
Fig3Protein structure prediction of wild and mutant sedlin
A：野生型sedlin结构，箭头所示是第43至45位组氨酸-丙氨酸-丙氨酸序列位置;B：突变型sedlin结构
是蛋白结合位点，sedlin通过它们参与蛋白相互作用的调节。本研究所发现的突变第43位组氨酸、44位丙氨酸就位于该疏水结构表面，因此该氨基酸序列缺失会破坏蛋白结合位点，影响其参与蛋白相互作用的调节［12］。
综上所述，本研究发现的SEDL新突变类型c.127_135delCATGCTGCT造成氨基酸序列第43至45位组氨酸-丙氨酸-丙氨酸序列缺失，可能是导致该家系SEDT的分子遗传学原因。对突变体进一步功能研究将有助于了解SEDL基因型与临床表型的关系。SEDL基因突变检测对SEDT患者的诊断、发现突变携带者及产前诊断具有一定的意义。
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(收稿日期:2012-02-22)
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