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乔思源，江文刚，汪思应
摘要目的探讨miR-lOO基因敲除小鼠模型的构建及基因鉴定o方法将引进的mlN-102al/g小鼠与Ella-Cre小鼠进行交配繁育出F1代小鼠，将F1代小鼠中基因型为miR-lOO""-的雌雄小鼠继续进行交配，获得F2代小鼠，待小鼠1周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定。结果结果显示有所需要的mlR-190基因敲除纯合子小鼠，将获得的敲除纯合子小鼠再交配，就可获得更多的基因敲除纯合子小鼠。F1代杂合子小鼠交配获得的F2代小鼠中出现3种基因型:miR-100聪/3»）、…^一100°-/-、miN-100"-，使用PCR法成功鉴定出了子代小鼠的基因型。同时剪取miN-100敲除纯合子小鼠、mlR-100al/»小鼠及mtT90敲除杂合子小鼠的耳朵提取RNA，然后进行qRT-PCR验证miN-100的表达情况。qRT-PCR结果显示,mlRP00基因全身敲除纯合子小鼠的耳朵中miN-100的表达几乎为零。结论该实验成功配繁出miR-20基因全身敲除的小鼠模型，为后续实验提供基础。
关键词mlR-190；基因敲除；基因型鉴定；繁育
中图分类号R332；Q78
文献标志码A文章编号1000-1492（2021）04-0519-04 doi:19.12405/jki.issnl000-1492.2021.04.002
miN-100是定位于人类染体Hq24.5上大小约为22个核苷酸的微小RNA o微小RNA是一类非编码的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，其通过与靶基因的3-TR结合而转录后抑制基因表达，以诱导基因或者蛋白质降解。目前对miR-NA的研究［］表明，miRNA几乎在每个细胞过程的调控中都起着至关重要的作用，包括增殖、凋亡、分化和血管生成等。miR-120在多种恶性肿瘤中发挥重要的调控作用，成为了近年来的研究热点。miR-120基因敲除模型的建立可以更好地研究miR-120在各种肿瘤等疾病中发挥作用的机制，从整体水平研究其功能。
2622-16-06接收
基金项目：国家自然科学基金（编号：81572749）
作者单位：安徽医科大学病理生理学教研室，合肥230632
作者简介：乔思源，女，硕士研究生；
汪思应，男，教授，博士生导师，责任作者,E-maiI:sywang@
miRP00arat/a。U小鼠是在C07BL/3小鼠的miR-120基因两端分别插入一个loxP的位点，所以外观上和C07BL/3小鼠基本没有差异。而Ella-Cre小鼠是表达Cre重组酶的工具鼠，可以特异性识别1。"位点从而将loxP位点间的基因敲除。该研究根据以上原理，通过将Ella-Cre小鼠与miR-120ep//ou小鼠进行配繁，得到miR-120敲除杂合子小鼠后再进行配繁，从而得到miR-120敲除纯合子小鼠。
1材料与方法
1.3实验动物SPF级miRP00fw a°U小鼠雌雄各3只和SPF级Ella-Cre小鼠雌雄各3只，体质量均在22g左右，购自南京大学模型动物研究中心，所有小鼠饲养在安徽医科大学实验动物中心的SPF环境中。经安徽医科大学实验动物中心审批，并严格遵循实验动物使用的原则。
13主要试剂与仪器琼脂糖粉末（广州赛国生物科技有限公司）;TAE（50X）电泳缓冲液（上海碧云天科技有限公司）；PCR试剂盒（广州赛国生物科技有限公司）；DNA引物（中国赛默飞世尔科技有限公司）；q PCR试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）；PCR扩增仪（普通）（德国耶拿分析仪器股份公司）；化学发光凝胶成像仪（北京汇佳科技有限公司）；荧光定量PCR仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。
1.3小鼠的饲养与繁殖小鼠在安徽医科大学基础医学院实验动物中心饲养和繁殖。温度控制在25C左右，湿度保持77%左右，明暗循环12h/d，自由饮食和饮水。小鼠笼盒、垫料、饲料、饮用水均经过高温高压消毒灭菌处理。饲养过程中，每2d进入动物房观察和记录小鼠的生长情况。每周更换1次小鼠垫料，每天补充饲料和饮用水。
1.3小鼠尾部组织基因组DNA的提取待子鼠1周龄时，将小鼠尾部组织剪取长约0.5cm的小段于1.5mi EP管中，在EP管中加入120m Buffee MP,4 jiiProtease Plus，轻微涡旋混匀。60C孵育25mN，然后90C处理0min,12006r/min离心
5mO o转移上清液至新的EP管中,4七或-22°C 放置备用或直接用于PCR扩增。
1.1PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定小鼠基因型鉴定引物序列:EIIa-Cre Cre-up：5'-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3'；EIIa-Cre Cre-/w：5'-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3'；miN-192 /xpF1:5'-TCTGGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC-3'；miN-192/xpR1:5z-CCTGAAGGGGATAAGGTTGCC c TCTCC；-miN-192hxpF2:5'-GGATGCCTTTTAGAG-TGGTAGACAC-3'；miN-192/xpR4：5'-CTGTCAGC1 CAAGTCTTCACTTrCTGC z；miN-192/xpF1：5'-TCT-GGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC1--miN-102/xpR-: 5^CTGTCAGCCAAGTCTTCACTTTCTG-1z-PCR反应体系：乂PCR mix19m，前引物
2.5m，后引物2.5□，超纯水5m/DNA模板4m h总体积22PCR 反应程序:EIIa-Cre程序为①25C、5min;②25 C、37s；③93C、35s；④72C、45s；⑤72C、3 min;⑥19C holl o②到④为循环反应，循环数为35o miNA92/Ip程序：①95C、5min；②25C、37s；
③92C、32s；④72C、37s；⑤72C、5min；⑥4
C holl o②到④为循环反应，循环数为37o miR-192nl［程序：①25C、5min；②25C、37s；③92 C、69s；④72C、37s；⑤72C、5min；⑥4C holl o②到④为循环反应，循环数为35。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖25g,5X TAE2ml，双蒸水98ml，漠化乙啶(EB)5ml,DNA样本19m h电泳电压92 V，时间44min，凝胶成像仪成像。
11基因型结果判定EIIa-Cre的引物扩增条带在481bp左右，为EIIa-Cre小鼠。miRA02-/xpF1和miRA02-/xpR1的引物扩增条带U ox在423bp, wildtyye在358bp。miN-192-/xpF2和miRA02Aox-pR-的引物扩增条带U ox在379bp,wildtyye在319 bp o miN-192-loxpF1和miRA02AoxpR4的引物扩增条带U ox在1585bp,wildtyye在1453bp，而nnl l在447bp o
1.7qPCR检测miR-100的表达剪取F2代小鼠的鼠耳提取RNA，进行逆转录，得到的cDNA再进行定量PCR o用吉玛公司的microRNA&U6snRNA HairnR-i严Normalization Quantitation RT-CCR试剂盒检测miN-192的表达。
1.0.0逆转录体系5x MMLV RT Buffer4m h ONTP
2.57m/miRNA&U6snRNA RT primer mix22 m/RNasin2.25m/MMLV Reverso Transcriptaso2.2 m/RNA样本根据各样本浓度及质量2m a计算其所需体积，最后加入DEPC水补足体积到22m h米用PCR仪进行扩增，反应条件为：25C、32min；42C、37min;85C、5min;4C保存。
1.0.0qPCR体系2x Real-time PCR Master Mix (SYBR)12m-,miRNA/U6snRNA specific Primersei
变形金刚卷土重来电影2.4mmo//,ROX refereace Oye2m/Taq DNA poh-meraso2.2m/cDNA样本加入2mh最后DE P C水补足22m-o定量PCR仪进行扩增，反应条件为: 25C、3min；95C39s；62C、42s,42个循环;4C 保存。
1.7统计学处理所有数据采用GraphPad POsm 6.2进行统计分析，实验结果以/土s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<
2.25为差异有统计学意义。
2结果
2.1小鼠的配繁母代的miNA92Uox//on小鼠与EI-Ia-Cre小鼠相互配繁成功得到F1代杂合子幼鼠，将获得的F1代小鼠雌雄相互交配得到F2代小鼠，其中就有miN-102全身敲除的纯合子，成功配繁出miN-192-/-基因型小鼠。每只母鼠妊娠期为19~ 21d，每胎产3~8只幼鼠。
2.2小鼠基因型鉴定结果①当5，端条带在423 bp和3，端条带在379bp,nnl l条带在1585bp时，为miRA02U。pU。n纯合子小鼠。②只有当5'端和3'端不表达条带，同时nnl l条带在447bp时为miR-100"-纯合子小鼠。③当不满足以上两种条带时都为敲除杂合子小鼠。F1代部分小鼠基因型鉴定结果见图2其中1号和2号条带满足①，所以为miR-192ep//on纯合子。而33333号小鼠的条带①、②都不满足，所以为miNA92Uox/-杂合子小鼠。将F1代miNA92Uox/-杂合子小鼠雌雄合笼配繁，产生F2代小鼠进行基因型鉴定，结果如图2，其中只有1、2、33号小鼠的条带符合②，所以为miN-192-八纯合子小鼠。
2.3敲除小鼠其miR-100表达情况为了进一步确认PCR结果的可靠性，选取经PCR鉴定获得的miRA02U°x/U°n纯合子、miNA92flo x/■杂合子、miR-192「八纯合子小鼠，用定量PCR的方法检测其miR-192的表达情况，结果如图3所示，相较于miR-W2flo p/flon纯合子表达(0.987189±2.219344),miR-192flo p/-杂合子的miN-192表达(2.746195±2.211252)降低，而miN-102-/-纯合子小鼠其miR-192的表达(2.002157±2.002009)几乎为零，差异
刘彦池整容前后照片有统计学意义（F = W 546. 096,P <2.021 ）0结果
与PCR 方法鉴定所得的结果一致，验证了 miN-H 的敲除效果，证实了 miR-lO 。全身敲除小鼠模型。
图1 F1代小鼠的基因型鉴定结果
14：均为小鼠miRC02纯合子小鼠2、4444 ：均为小鼠miR- 102敲除杂合子小鼠
500400300
1500
500400
Null
FL/WT
刘亦菲资料图2 F2代小鼠的基因型鉴定结果
1444：均为所需的miR-100敲除纯合子小鼠2444：均为吉他指法
miR-H 杂合子小鼠
***
小鼠编号
图3 F2代小鼠的miN-100表达情况
14：miR-100敲除纯合子小鼠;2 imiR-m 敲除杂合子小鼠2 ：
miR-100fWflt 纯合子小鼠；与1组比较:… P<0. 001
3讨论
作为研究最多的非编码RNA,miRNA 是短的
（约22个核苷酸）内源性非编码RNA，通过与靶标
的3,-UTR 结合促进mRNA 降解并抑制转译在转录 后水平调节基因表达［2-7］o 研究⑷表明，超过50% 的miRNA 位于染体上的所谓的脆性区域中，这些
染体经常被删除，扩增或重排与癌症相关。有研 究［5-6］表明,miRNA 表达的异常表达模式和功能异
常已被确定与包括癌症在内的多种人类疾病相关。 研究［7］表明，miR-100是miR-99家族的一员，其起
源可以追溯到两侧对称动物的祖先。miR-100在肿
瘤进展中的表达模式和作用尚未完全阐明，近期的 研究［8'9 ］显示了有争议的结果。在人类癌症中，
miR-100被报道71 ］既可以作为致癌miRNA，也可以
作为抑癌miRNA，这取决于肿瘤类型和微环境。已 经有报道71称miR-100的失调参与了肿瘤的发生、
发展和耐药。miR-100的下调在多种人类肿瘤中被 报道，如非小细胞肺癌（NSCLC ）72'胃癌（GC ）、肝
细胞癌（HCC ）70 ］ o 该课题组前期建立的miR-100
肝特异性敲除小鼠模型，在成年小鼠中,miR-100基
因敲除对肝功能和形态没有影响。在老年小鼠中，
HE 染显示miR-100敲除可引起炎症细胞浸润和
肝细胞核扩展，而且miR-100基因敲除的老年小鼠 血清AST 和ALT 水平升高，表明其肝功能受损74 o
Cre/lrxP 系统是一种广泛应用于小鼠位点特异
代理服务器的使用性基因操作的技术。该系统允许删除特定细胞、组
织和整个生物体中感兴趣的基因，从而产生多种条
件敲除小鼠品系。Cre/ltP 系统是一种位点特异性
的遗传调节技术，广泛应用于小鼠特定DNA 位点的 基因缺失、插入、逆转录和易位70 ］ o 该系统包含两
个主要成分:Cre 重组酶和loxP 位点° Cre 重组酶可
以特异性识别具有方向性的34碱基对不对称DNA
序列的loxP 位点。根据两个loxP 位点的定位,Cre
重组酶可以切除或逆转插入两个lxxP 位点之间的 转基因序列。基于此，本课题组选择了 miR- 100论恥小鼠，此类小鼠的miR-100基因两端分别被
插入了一个loxP 位点，然后将其和表达Cre 重组酶
的Ella-Cre 小鼠交配，从而能够获得miR-100被敲
除的杂合子且表达Cre 的小鼠，再将其进行交配就
可获得miR-100被敲除的纯合子小鼠，成功建立
miR-100基因敲除小鼠模型，并按照SPF 级标准进
行饲养繁育。采用较为简便易行、重复性、适用性较
好的琼脂糖凝胶电泳的方法进行基因型鉴定。
虽然
大明风华胡善祥结局在饲养过程中，还没有发现miR-120的敲除和未敲除的小鼠有明显差别，但是为后续对miR-120基因的相关机制深入探究提供了较好的模型。
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Construction and genotyping of miR-H0knockout mouse model
Qiav Siyyan,eiang Wecgang,Wang Siying
(Dept of PhophyHogy,Ahud Medical Uhversita,Hefus230032)
Abstract Objective Tv explore the constrnction and inectification of miR-120gecc knochoni monse mon—. Methods The intronuceV miR-122flop/flou mica were matef with Ella-Cre mica te p/U uco F1heterozyyons mNc. The maic ang femaic mica with miR-122floP/-gepotyyc were furthce matef te oUtain F2geceration mNo.Whec the mica were1weef o IU,the tait C ss/vw—u coi te extract DNA,he targei gecc fragmeci was ampliPeP by PCR,eng the gecotypc was determinef by agarose gel V—eo
pho/sis.Resulih Among them,there were miR-120knochoUi homozyyoUS mica.If the oUtainef knvchoUi homozyyoUS mica were matef,more knochoUi homozyyoUS mica cou IU ba oUtened.By cotting the mouse care te extract the RNA,the mouse RNA cou IU be extracted withoui akecting the lie c P the mouse.Therefore,the ecru of miR-120knochoui homozyyous mica,miR-100floP/flou mica,ang miR-120knoch1 oui heterozyyous mica were coi te extract RNA,ang they qPCR was pe/ormef te ye/fy the expression of miRP22. The breefing ang^1x11101100of miR-120gecc knochoui mica were successful,and stable g—otic knochoui mica were oPtUrof.Three gecotypcs were found in F2geferabon mica matef with F1heterozyyous mica:miR1 120flo//flou,miR-100floP/_,ank miR-120""2The g—otypcs cP the offsy/ng mica were sue—sfuliy ipeftifief by PCR.qPCR usuUs sUowef that the expression of miR-102in the ecru of the whol—bo/y knochoui homozyyous mica was almost z—e.C onclusion In this study,a mouse mo/ei of whol—bony deletion of miR-120g—v is succ—sfuliy clonef,providing a basis foe subs—qi—k—p—im—ks.
Key woad miR-120;gepe knochoui;gvotypc idectificabon;breefing
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