第47 卷第 5期2021 年给水排水WATER &. WASTEWATER ENGINEERING Vol. 47 No. 5 2021
生活饮用水中嗜肺军团菌的酶底物测定方法研究
黄晨铭张岚张晓韩嘉艺高圣华
(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京100021)
摘要：采用加标比对试验探索培养温度和时间对酶底物法检测饮用水中嗜肺军团菌的影响；在 确定最适培养条件后，采集饮用水水样进行检测并通过16S rD N A序列GenBank比对试验对阳性结 果进行确证。结果表明，酶底物法检测饮用水中嗜肺军团菌的最适培养条件为39 °C恒温培养7 d，嗜肺军团菌检出浓度与理论浓度基本一致，加标回收率范围为98. 4%〜108. 8%；对北方城市部分饮 用水水样进行嗜肺军团菌检测，检测发现阳性水样4份，经乳胶凝集血清分型试验和16S rD N A序 列分析确证均为嗜肺军团菌。
关键词：饮用水；嗜肺军团菌；酶底物法；培养条件；16S rDNA
中图分类号：T U991 文献标识码：A文章编号：1002 —8471(2021)05—0021 —06
DOI：10. 13789/jki.w w el964. 2021. 05. 004
引用本文：黄晨铭，张岚，张晓，等.生活饮用水中嗜肺军团菌的酶底物测定方法研究[J].给水
排水，2021，47(5):21-26. HUANG C M，ZHANG L，ZHANG X，et al.Study on the determi
nation method of enzyme substrate of户,zewmo/j/n./a in drinking water[J].Water
Wastewater Engineering,2021,47(5) ：21-26.
Study on the determination method of enzyme substrate of L e g io n e lla
p n e u m o p h ila in drinking water
HUANG Chenming，ZHANG Lan，ZHANG X iao，HAN Jiayi，GAO Shenghua
(National Institute o f Environmental Healthy Chinese Center for Disease Control and
Prevention，Beijin g100021，China)
Abstract：In this study,we used a spiked comparison test to explore the effects of culture temperatur
e and time on the enzyme substrate method for detecting Legionella pneumophila in drinking water；After determining the most suitable culture conditions,we collected drinking water samples for testing and confirmed the positive results by 16S rDNA sequence GenBank comparison test.
The results showed that the optimal culture condition for the detection of Legionella pneumophila in drinking water by the enzyme substrate method was 39 °C constant temperature culture for 7 days,the detected concentration of Legionella pneumophila is basically the same as the theoretical concentration and the spiked recovery rate ranged from98. 4%to108. 8%；This study detected Legionella pneumophila in some drinking water samples from northern cities and found 4 positive water samples.Both methods of latex agglutination serotyping test and 16S rDNA sequence analysis are confirmed that they were all Legionella pneumophila.
Keywords：Drinking water；Legionella pneumophila ；Enzyme substrate；Culture conditions；
16S rDNA
21
第 47 卷第 5 期2021 年给水排水WATER & WASTEWATER ENGINEER丨NG Vol. 47 No. 5 2021
〇引言
军团菌(Le^'ow//a)是一种常见的水源性致病 微生物.广泛存在于各种水环境中，特别是在包括饮 用水在内的人工水体中。目前空调冷却水、喷泉水 等非饮用水中军团菌污染问题已引起各国研究者的 广泛关注[1]，而饮用水中军团菌污染的相关研究较 少。但近年来饮用水系统被军团菌污染事件时有发 生24]，特别是2020年受新冠疫情的影响.多数建筑 长期封闭导致供水系统长时间水流停滞，为军团菌 的生长繁殖提供有利条件[5]。2020年5至7月美 国有报道称，包括美国疾控中心多处办公楼在内的 供水系统、度假酒店的自来水以及大学校园的建筑 供水均检出军团菌W。感染军团菌可引起严重的呼 吸道传染病，其中嗜肺军团菌
/>/!//〃，L P)与人类疾病关系最为密切[78]。目前我 国现行《生活饮用水卫生标准》（GB 5749 —2006)未 对军团菌指标提出控制要求，现有的微生物指标也 无法准确提示军团菌污染水平[9]。但美国环保署 (US~EP A)2001年颁布的《国家饮用水水质标准》(EPA 816-F-09-004)中国家一级饮用水规程规定军 团菌最大污染水平的控制目标为零[1°]。世界卫生 组织(WH())2011年发布的《饮用水水质准则》第四 版也已将军团菌列入12种水源性病原体之一，明确 其卫生学意义重大[11]。
分离培养法是目前国际通用检测军团菌的“金标准”，适用于各种环境水体。但也有研究者提出该方法存在操作繁琐，检测周期较长，易受杂 菌十扰等缺陷[1213]。近些年出现了多种新的嗜肺 军团菌定量
检测方法。其中.酶底物法作为一种同时适用于饮用水和非饮用水的嗜肺军团菌检测 方法备受关注。北美、欧洲、日本等国家相继对该 方法进行了能力验证及应用.普遍认为酶底物法具有操作简单、灵敏性高的特点，可用于检测饮用 水中嗜肺军团菌。目前，我国还未对该方法在检测饮用水中嗜肺军团菌的可行性进行研究。基于此.本研究拟通过加标试验对酶底物法检测饮用水中嗜肺军团菌最适宜的培养条件进行探索，并运用该方法对饮用水水样进行检测分析，为进一步探索适用于饮用水中嗜肺军团菌的检测方 法提供参考依据。1材料与方法
1.1试验用菌种
试验所用的嗜肺军团菌质控样品NCTC 11192 (ATCC 33152)购置于美国爱德士生物科技公司(IDEXX)，单只质控样真值为1 604±335 MPN/ 100 mL0
1.2仪器和试剂
程控定量封口机（IDE X X)，恒温培养箱，涡旋 振荡器，生物安全柜，离心机，水浴锅，移液；酶底 物培养基、定量盘（1DEXX)，乳胶凝集试剂盒（（)X-()ID)，军团菌诊断血清试剂1-15型（天津生物芯 片），BCYE和 BCYE-CYE培养基（陆桥），QIAamp DNA Mini Kit试剂盒(QIAGEN)。
1.3培养条件
1.3. 1方法原理
酶底物法是一种以细菌酶检测技术为基础，基 于最可能数（most probable number，MPN)方法的 定量检测方法。嗜肺军团菌利用酶底物试剂中丰富 的氨基酸、维生素和其他营养成分迅速生长繁殖，同时会利用额外添加的酶底物反应生成一种棕的指 示物使溶液显褐或者浑浊。
1.3.2培养条件设置
本研究拟对培养温度和培养时间进行考察。根 据分离培养法中军团菌最适培养温度为36±1 °C以及酶底物法中建议的饮用水中嗜肺军团菌培养温度 为39 °C，本研究将培养温度设定为5组：33 °C、36 °C、39 °C、42 °C、45 °C，每个温度条件设9个平行 样，并在培养箱中放人一个装有足量水的托盘，以保 持培养箱中湿度适宜。培养时间设定为11 d，样品 在培养过程中每隔24 h观察记录96孔定量盘的颜 和浊度变化，从第1d到第11 d持续观察。
1.3.3培养方法
嗜肺军团菌质控样品用适量无菌去离子水稀 释，配制成高、中、低（321±67"?以10〇1111.、64±13 MPN/100 m L、8土2 MPN/100 m L)三种不同浓 度的100 m L菌悬液作为阳性待测样品。在待测样 品中加入酶底物培养基，振荡混匀并倒人96孔定量 盘中，轻拍定量盘排出空气后放入程控定量封口机
中封口，最后将定量盘纸片一面朝下，在33 °C、36 °C、39 °C、42 °C、45 °C温度条件下培养。同时，用
22
第 47 卷第 5 期 2021 年 给水排水 WATER &. WASTEWATER ENGINEERING V o U 7 No. 5 2021山河无恙 人间皆安 什么意思
无菌水代替阳性待测样品.其他操作步骤同上述一 致，设为阴性对照。1.3.4结果判读
相对阴性对照而言.无论浑浊与否，任何显褐 的迹象均认为嗜肺军团菌阳性；相对阴性对照而言， 无论是否显褐，浊度大于阴性对照即认为嗜肺军 团菌阳性；如颜与浊度方面与阴性对照无差异，认 为嗜肺军团菌阴性。根据以上标准判读结果，数出 显阳性的大小孔格数，对照M P N 表得到嗜肺军团 菌浓度(MPN /100m L )。1.4饮用水水样检测1. 4. 1
水样的米集和检测(1)
采集水样：于2020年6月随机无菌采集北 方某城市饮用水水样，每份样品100 m L 。水样低温 运输回实验室后室温储存，3 d 内进行酶底物法 检测。
周冬雨否认恋情(2)
培养方法：用水硬度测试条测定水样的硬 度。根据水的硬度进行预处理:〇〜2个显条呈阳 性为低硬度，需向100 m L 水样中加入酶底物补充 剂0. 33 mL ，3〜4个显条呈阳性为高硬度，需向 100 m L 水样中加人酶底物补充剂1 mL 。加入酶底 物培养基到混合液中，振荡混匀.倒盘封口。按照条 件探索试验确定的最适培养条件培养，同时设置阴
性对照。结果判读同1.3.4。1.4.2阳性孔确证试验
本研究同时采用血清凝集和16S rDN A 测序两 种方法对阳性结果进行确证实验。
(1) 血清凝集法：用接种环取10
阳性菌悬液
涂布于B C Y E 和BCYE -C Y E 培养基上，在C ()2培 养箱37 °C 培养2〜4 d 。对在B C Y E 上生长、BCYE - C Y E 上无生长的菌落进行血清凝集型别鉴定.可分 出血清1-15型。
(2)
16S rD N A 序列分析：D N A 提取步骤按照 QIAampDNA Mini K i t 试剂盒说明书进行；16S
表1
rD N A 引物信息：引物F 为5'-GTTAAGTCCCG - CAACGA -3'；引物 R 为 Y -CCAACAGCTAGTT - GACATC 03'，由某基因科技有限公司合成。PCR 体系：1
模板，15 pL Super M ix ，1 juL Primer F
(10p )，1 pL Primer R (10p )，12juL ddH 2C )，共 3〇/^。反应程序：96°(：预变形5 11^;96°〇变性 20 s ，
62 °C 退火20 s ，72 °C 延伸30 s ，35个循环；最 后，72 °C 延伸10 min 。扩增后取3 pL P C R 产物进 行1.0%的琼脂糖凝胶检测并观察条带性状；PCR 产物纯化按照磁珠纯化标准操作流程操作；纯化后
的P C R 产物由某基因科技有限公司进行16S rD NA 测序分析。
1.5质量控制
ATCC 33152为本次研究阳性对照质控菌株。1. 6
统计分析
数据采用SPSS 19. 0统计软件进行统计分析。
嗜肺军团菌加标回收试验结果的比较采用单因素方
差分析。
2结果 2.1培养条件2. 1. 1培养温度
加标试验结果显示，当培养温度为33 °C 时.嗜肺 军团菌加标回收率在21. 3%〜75%；当培养温度为 36 °C 时，嗜肺军团菌最大检出浓度接近加标浓度，加 标回收率在89. 5%〜105%；当培养温度为39 °C 时， 嗜肺军团菌最大检出浓度与加标浓度基本一致，加标 回收率在98. 4%〜108. 8%；当培养温度为42 °C 时, 嗜肺军团菌最大检出浓度偏低.加标回收率在 25. 8%〜51.4%；当培养温度为45 °C 时，嗜肺军团菌 最大检出浓度明显偏低，加标回收率<34. 6%。采用 单因素方差分析进行统计学分析，结果显示F = 17. 904C 0. 05，认为5组数据有显著性差异，具体数 据见表1。单因素方差分析两两比较结果显示，39 °C
组与36 °C 组数据没有统计学差异0=0. 576)。
不同培养温度嗜肺军团菌最大检出浓度（MPN/10Uml.)和加标回收率（％)
lab. 1 Maximum detectable concentration of Ijegionella pneunviphila (MPN/lOOml.) and standard recover\ rate (%) at different culture ten^eratures
阳性加标培养温度样品浓度
45 V
42 r
39 r
36 X ：33 r
高浓度111. 1(34. 6%)165.9(51.4%)315.7(98.4%)287.3(89.5%)129.2(40.2%)中浓度11.3(17.7%)16.5(25.8%)67.7(101.7%)59.5(93.0%)15.2(23.-1%)低浓度 1.0(12.5%)
2.4(26.3%)
8.7(108.8%)白居易诗全集
8.4(105.0%)
6.3(75.0%)
注：经单因素方差分析，/><0.05;
23
1 23456789 10 11
培养时间/d
a 高浓度嗜肺军团菌的生长曲线
培养时间/d
b 中浓度嗜肺军团菌的生长曲线
1
2345
678
9 10 11
培养时间/d
c 低浓度嗜肺军团菌的生长曲线
图1
不同浓度嗜肺军团菌随时间变化生长曲线
Fig. 1 Growth curve of different concentrations of Legionella
pneumophila over time
83 j A B 571023 1 I^gionella gresilensis
40 T A B 571022 1 Legionella busanensis 34^ A B 2111711 l^gionella spiritettsis 43 A B 571024 I I^gionella tpiinhvanii 53^? A B 570377 ionetla tondiniemis 97 j A B 537503 1 Legionella rubrilucens
A B 185329 1 I^egionella pneumophila A B 185331.1 l^e^umella sainthele/isi
：----------------------r E U 153382.1 Legionella anisa
100 1780 1 Legionella sp
I iLp-NO -,'CP 048e \S6\%.\ Legionella p neumophila 丨 |Lp-N0 2
73 LR134380 I U gio n ella pneumophila subsp. pascullei
图2
基于16SrD N A 测序结果的嗜肺军团菌系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of Legionella pneumophila based on
I6S rDNA sequencing results
存，最佳生存温度为25〜42 °C [22 23]。研究表明，当 酶底物法培养温度高至42 °C 以上或低至33 °C 以下
2. 1.2培养时间
由图l a 可知.嗜肺军团菌阳性样品在高浓度 时，当培养温度为45 °C 、42 °C 、39 °C 、36 °C 时，第 4 d 开始出现阳性现象,45°C 、42 °C 、39 °C 时第7 d 结果趋于稳定，36 °C 条件下第8 d 结果趋于稳定；当 培养温度为33 °C 时，第6 d 开始观察到阳性现象， 直到第11 d 未观察到连续稳定结果即未达到最大 检出浓度。由图l b 可知，嗜肺军团菌阳性样品在中 浓度，培养温度为42 °C 、39°C 、36 °C 时，第4 d 开始 观察到阳性现象，并分别在第6 d 、第7 d 、第9 d 结 果趋于稳定；当培养温度为45°C 、33°C 时，第5 d 开 始观察到阳性现象，并分别在第6 d 和第10 d 结果 趋于稳定。由图l c 可知，嗜肺军团菌阳性样品在低 浓度，培养温度为45 °C 时，未观察到阳性现象，分 析可能是温度过高导致嗜肺军团菌死亡或者活性消 失；当培养温度为42 °C 时，在第5 d 出现阳性现象， 第6 (1结果趋于稳定；当培养温度为39°C 、36°C 时， 第4 d 开始观察到阳性现象，分别在第6 d 和第9 d 结果趋于稳定；当培养温度为33 °C 时，在第6 d 观 察到阳性现象，第10 d 结果趋于稳定。2.2饮用水水样检测
本研究采用酶底物法对采集的饮用水水样进行 了嗜肺军团菌检测，共检出嗜肺军团菌阳性样品4 份，分离获得4株嗜肺军团菌.通过乳胶凝集血清学 分型分别为1型、15型、7型、10型嗜肺军团菌；另 外通过16S rD N A 测序分析对其进行菌株确证，结 果显示，分离的4株菌均属嗜肺军团菌，表现为2种 基因型，命名为Lp -N (). 1和Lp -NO . 2。其中Lp - N (). 1有2株，对应的血清型为1型和7型；Lp - NO .2有2株，对应的血清型为10型和15型。根 据 Blast 结果显示，Lp -NO . 1 株与 CP 048 618. 1 Le - p 'owW /a 亲缘关系最近，相似性为100% ;Lp ~NO . 2 与 L R 134 380. 1
»?«/>/!//«
亲缘关系最近，相似性为
99. 77%。现基于16S rD N A 测序结果建立的系统
发育树如图2所示。3
讨论
3. 1培养温度和培养时间
培养温度是影响嗜肺军团菌生长繁殖的重要因 素.-般认为军团菌可在20〜50 °C 的水温环境下生
第 47 卷第 5 期 2021 年 给水排水 WATER WASTEWATER ENGINEERING Vol. 47 No. 5 2021
5
2 9 6
3
4 4 3 3 3H
H
+
Twool /N i ^
崁
壬鉬
P
P P P P
5 2 9 6
3
4 4 3 3
3-H H t
o
o
o
o
o
o
o
5 0 5 0
5 0
5
3 3 2 2 1 10
01/£2钯崁
-33^
24
第47 卷第 5期2021 年给水排水WATER &• WASTEWATER ENGINEERING Vol. 47 No. 5 2021
时，嗜肺军团菌最大检出浓度均明显低于理论浓度 的50%，即加标回收率均低于50%，说明高温可以 杀灭嗜肺军团菌或使其活性丧失，而温度过低又会 导致嗜肺军团菌活性降低，使显反应延迟或不发 生。本研究中，当培养温度为39 °C和36 °C时，嗜肺 军团菌最大检出浓度值与理论浓度值基本一致，即均可达到较高的加标回收率，为较适宜的培养温度，且从图2的指数增长曲线可以看出39 °C时嗜肺军 团菌最大检出浓度比36 °C时更接近理论浓度值，但 未发现两者存在统计学差异。
培养时间对酶底物法具有显著的影响。相同温 度条件下，随着培养时间的增加，嗜肺军团菌检出率 增高。当温度>39°C时指数增长阶段集中在第4〜7 d，当温度<39 °C时指数增长阶段集中在第4〜10 d。结合培养温度的研究结果，重点比较39 °C和 36 °C培养温度下嗜肺军团菌的生长趋势。结果显 示，当培养温度为39 °C时，高中低浓度阳性样品均 能稳定在第4 d开始出现阳性显现象，并在第6 d 或第7 d达到最大检出浓度；当培养温度为36 °C 时，高中低浓度阳性样品均在第4 d开始出现阳性 显现象，并在第8 d或第9 d达到最大检出浓度。综合考虑培养温度与培养时间.在保证高回收率的 同时尽可能缩短培养周期，本研究认为酶底物法在 39 °C条件下，选择7 d作为培养时间，嗜肺军团菌的 检出效果最好。
3.2方法的特异性
本研究通过酶底物法对北方某城市的部分饮用 水水样进行检测，共检出嗜肺军团菌阳性4份.通过 血清分型试验和16S rD N A序列分析对阳性样品进 行确证，两种确证方法结果一致，4份阳性样品均为 嗜肺军团菌。结果表明，本研究通过酶底物法检测 获得的4份嗜肺军团菌阳性水样特异性为100%，这与Spies K等人的研究结果相同[21]。
4结论
嗜肺军团菌是饮用水中存在的潜在条件致病病 原体。随着城市化发展进程加快，嗜肺军团菌在饮 用水系统中滋生并传播的风险日益增大。因此加强 对饮用水中嗜肺军团菌的检测和控制对保障用水安 全至关重要。通过试验证明，酶底物法检测饮用水 中嗜肺军团菌的最适宜培养条件为39 °C恒温培养7 d。在适宜条件下，酶底物法检测饮用水中嗜肺军 团菌具有良好的稳定性和特异性，并具有操作简单、结果易于判读等特点，在检测饮用水中嗜肺军团菌 领域具有良好的发展和应用前景。
参考文献
[1] JOMEHZADEH N, MOOSAVIAN M, SAKI M, et al. Le-
gionella and legionnaires disease：An overview[J]. Journal of
Acute Disease，2019，8(6):221-232.
[2]NAKAMURA I. MIURA Y, UMEDA A, et al. The Legio
nella contamination of tap water in a brand-new hospital in Ja
pan before patients move in[J]. Infection Control and Hospi
tal Epidemiology. 2020♦41(8) ：998-999.枕着你的名字入眠
[3]PASQUALINA, LAGANA, ALESSIO, et al. Environmen
tal Surveillance of Legionellosis within an Italian University
Hospital-Results of 15 Years of Analysis [J].International
Journal of Environmental Research and Public Health，2019，
16(7)：1103.
[4]GIROLAMINI L, MAZZOTTA M, LIZZADRO J» et al. Sit
bath system s：A new source of Legionella infection[J]. PI刀S
ONE, 2020, 15(11)：e0241756.
[5 ] DEEM S. Preparing for COVID s Effect on Legionella and
鹿晗整容Building Water System s[J]. Journal-American Water Works
Association，2020，112(9):60-62.
[6 ]DEY R, ASH BO LT N J. Legionella Infection during and af
ter the COVID-19 Pandemic[J]. 2020.
[7]CUNHA B A, BURILLO A, BOUZA E. Legionnaires dis-
e a s e[J]. I,ancet (London，England)，2016，387(10016):
376-385.
[8]YU V L, PLO UFFE J F, PASTORIS M C, et al. Distribu
tion of Legionella species and serogroups isolated by culture in
patients with sporadic community-acquired legionellosis：an
international collaborative survey [J]. The Journal of Infec
tious Diseases* 2002* 186(1)：127-128.
[9 ] GB 5749 — 2006生活饮用水卫生标准[S]•中华人民共和国卫
生部.中国国家标准化委员会.北京：中国标准出版社，2007. [10] EPA 816-F-09-004. National primary drinking water regula
tions [S]. Washington DC»2009.
[11] WHO. Guidelines for drinking-water quality [M]. 4th edi
tion. Switzerland：WHO Press, 2017.
[12] KIRSCHNER A K T. Determination of viable legionellae in
中国计量大学现代科技学院engineered water system s：Do we find what we are looking
for? [J]. Water Research，2016，93:276-288.
[13]吕恒，张锦海，陈凤娟，等.军团菌检测方法概述[J].东南国
防医药，2014(2): 177-180.
[14] SCATURRO M, BUFFONI M, GIROLAMO A, et al. Per
formance of Legiolert Test vs. ISO 11731 to Confirm Legio
nella pneumophila Contamination in Potable Water Samples
[J]. Pathogens，2020，9(9):690.
[15] KIRSTEN S, STEFA N P, BERND L, et al. Comparison of
the Legiolert/Quanti-Tray MPN test for the enumeration of
Legionella pneumophila from potable water samples with the
25
发布评论